Ферменты анаэробного окисления - восстановления в протонных циклах бактериальных мембран Баграмян, Каринэ Альбертовна

Введение к работе

Актуальность проблемы., Изучение структуры биологических мембран и принципов их функционирования на молекулярном уровне с помощью современных физико-химических методов и биофизических приемов продолжает занимать ведущее место в проблемах биофизики.

С одной стороны это связано с тем, что биологические мембраны обеспечивают интеграцию метаболизма в клетке, поддерживая ионный, энергетический и другие виды гомеостаза. С другой стороны, они сами непосредственно участвуют в протекании ряда важнейших процессов в клетке, ключевыми из которых являются транспортные и энергозапасающие, и осуществление которых, в принципе, невозможно без создания пространственно ориентированных целостных структур, функционирующих как мулътибелковые ансамбЯи.

Почти все формы жизни запасают энергию в процессе дыхания, предполагающего спонтанный, термодинамически благоприятный перенос электронов от подходящего донора через комплекс мембранно-спязанных редокс-белков, ферментов и электронных переносчиков на подходящий акцептор. Векторный перенос протонов через мембрану приводит к запасанию энергии в форме протондвижущей силы с участием АТФсинтетазы, утилизирующей эту энергию для сопряжения обратного переноса протонов через мембрану для синтеза АТФ из АДФ и Ф„ (Mitchell, 1961). Обязательным условием для нормального протекания процесса является, согласно хемиосмотической теории Митчелла (Mitchell, 1968), наличие целостной неповрежденной мембраны.

Высшие формы жизни обычно используют НАДН, образуемый в результате окисления глюкозы, в качестве донора электронов с молекулярным кислородом в качестве их акцептора в процессе работы мультикомплексной митохондриальной дыхательной цепи (Nicholls and Ferguson, 1992; Zaslavsky and Gennis, 2000; Futai et al, 2000; Friedrich, 2001; Roth and Hagerhall, 2001). Вместе с тем, существует огромное количество микроорганизмов, отличающихся по характеру электронных доноров и акцепторов, используемых в дыхательных целях. Некоторые из них содержат дыхательную цепь, использующую вместо донор/акцепторной пары ЫАДН/кислород такие соединения, как метан, аммиак, диметилсульфоксид (ДМСО), водород или моноксид углерода в качестве доноров, и диоксид углерода, нитрат, сульфат или ион железа в качестве акцепторов (Thauer et al, 1977; Fiala and Stetter, 1986; Yu and Quinn, 1994; Schafer et al, 1996; Unden and Bongaerts, 1998; Ide et al, 1999; Rothery et al, 1999; Biel et al, 2002). В этих случаях специализированные ферменты оксидоредуктазного типа участвуют в передаче электронов в комплексы дыхательных цепей, которые с участием органических (хинонов) и белковых редокс-псреносчиков восстанавливают соответствующий акцептор электронов.

Естественно, что наиболее простым и доступным акцептором электронов для дыхательной цепи является протон и, почему бы ему не быть использованным в качестве терминального акцептора для анаэробного дыхания? Восстановление протона имеет своп преимущества, так как образуемый продукт, высокоэнергетичный восстановитель - газ, молекулярный водород (Н₂) (Weaver et al, 1980; Nandi and Sengupta, 1998; Kuenen, 1999), легко удаляется из клетки. Однако Н₂ больше производится ферментирующими микроорганизмами (Adams and Stiefel, 1998; Sawers, 1999; Beinert, 2000; Vignas et al, 2001; Olson and Maier, 2002), чем "дышащими". Первые синтезируют АТФ только за счет прямого, непосредственного фосфорилирования АДФ с использованием высокоэнергетических соединений (Lehninger et al, 1993; Berry, 2002). В отсутствие дыхательной системы, использующей электроны, эти организмы должны избавляться от избытка таких восстановителей, как восстановленные углеродные соединения, этанол, или же Н₂.

Escherichia coli в отсутствие внешних акцепторов электронов дыхательной цепи получает энергию в процессе смешанного сбраживания углеводов (Sawers, 1999). Основным источником восстановительных эквивалентов для производства Н₂ у них служит пируват, образуемый в процессе ферментации (Nicholls and Ferguson, 1992; Lehninger et al, 1993) с участием анаэробного ферментного комплекса - формиат-водород-лиаза (ФВЛ). Два пути водородного метаболизма, каждый из которых требует гидрогеназной активности в составе ФВЛ, были идентифицированы в анаэробно выращенных Е. coli. В этих условиях бактерии синтезируют три [NiFeJ-гидрогеназы, описанные как гидрогеназа 1 (Нуа), гидрогеназа 2 (Hyb) и гидрогеназа 3 (Нус) (Ballantine and Boxer, 1985; Sawers et al, 1985; Bohm et al, 1990; Menon et al, 1990; Sauter et al, 1992; Sawers, 1994; Gennis and Stewart, 1996; Sargent et al, 1998). Андрюс с соавторами (Andrews et al, 1997) обнаружили дополнительный оперон, который, как предполагается, кодирует новую протон-транслоцирующую [NiFeJ-гидрогеназу, названную гидрогеназой 4 (Hyf). Все они катализируют обратимое окисление - восстановление Н₂.

Другое интересное наблюдение указывало на связь между активностью ФВЛ, F₀F| Н⁺-АТФазной активностью и поглощением ионов калия (основным внутриклеточным катионом для всех типов клеток) у анаэробных Е. coli, выращенных в условиях ферментации (Bagramyan and Martirosov, 1989; Trchounian, 1997; Trchounian et al, 1997). Модель мембранного АТФ-зависимого ионного транспортного комплекса (Trchounian, 2004), функционирующего как насос при посредничестве Дцн⁺, разрабатывалась на протяжении последней четверти _t века и представляла несомненный биоэнергетический и биофизический интерес. Она указывала на то, что TrkA и F₀F| системы сопряжены, по крайней мере в условиях анаэробной ферментации, с формированием АТФ-зависимого насоса, генерирующего высокий градиент ионов К⁺ через мембрану для стабилизации Д/іц⁺- Механизм,

управляющий таким сопряжением, представляет большой интерес как со структурной, так и энергетической точек зрения.

Исследования, проведенные в нашей лаборатории (Bagramyan and Martirosov, 1989; Trchounian et a/., 1997; Trchounian, 1997), показали, что как ФВЛ-активность, так и поглощение ионов К⁺, опосредованное через TrkA, являются Fo-зависимыми. Более того, предполагалось, что активность гидрогеназы 3, компоненты ФВЛ, абсолютно необходима для поглощения ионов К⁺ TrkA системой. В штаммах Е. coli, несущих мутации в F₀F_rATa3e, производство Н₂ в процессе роста в условиях ферментации резко сокращалось, демонстрируя факт отсутствия активности ФВЛ в них (Trchounian etal., 1997). В мутантах, не способных "производить" ФВЛ, а следовательно, и Н₂, поглощение К⁺ через TrkA-систему теряло характеристики, присущие 2Н⁺-К⁺-обмену. Более того, результаты (Bagramyan, Martirosov, 1989; Trchounian et al, 1997; Trchounian, 1997) объясняли проблему структурного объединения и механизма передачи энергии, указывая на участие SH-rpynn в работе F₀Fi и TrkA, а перенос энергии - в рамках модели дитиол-дисульфидных переходов (Martirosov, 1990). При брожении в цитоплазме бактерий содержится больше восстановленных молекул, чем в периплазме, что создает благоприятные условия для функционирования данных белков (Ritz and Beckwith, 2001; Katzen and Beckwith, 2002). Редокс-потенцнал, в принципе, мог бы являться фактором регуляции активности данных транспортных систем и связанных с мембраной ферментов за счет окисления или восстановления этих тполовых групп.

Таким образом, вся совокупность имеющихся данных косвенно указывала на необходимость ФВЛ в процессе 2Н⁺-К⁺-обмена и производства Н₂ у анаэробно выращенных, осуществляющих ферментацию Е. coli. Предположение о необходимости FoFi-АТФазы для активности ФВЛ у выращенных анаэробно, осуществляющих брожение Salmonella tiphy murium подтверждалось и данными, приведенными в работе Сасахары с соавторами (Sasahara et al., 1997).

Однако, роль ФВЛ в анаэробном брожении, вообще, и в формировании внутримембранного транспортного механизма, описанного выше, оставалась неясной. Каким образом осуществляется взаимодействие F₀F| и TrkA и что обеспечивает пространственную связь этих генетически независимых структур внутри мембраны? Как осуществляется передача энергии от первичной энерго-донорной системы F₀F) ко вторичной, энерго-потребляющей системе, является ли F₀F| единственным поставщиком энергии для TrkA, переносящей ионы К⁺ против их концентрационного градиента, поскольку ни одна из этих систем не обладает окислительно - восстановительными локусами, которые могли бы быть потенциальными участниками акта передачи энергии и восстановительных эквивалентов. И последнее, каким образом регулируется работа такого сложного механизма?

Гипертермофильный археон Pyrococcus furiosus явился наиболее удобной моделью для развития данных исследований. Во-первых, этот организм считается предком для всех облигатных прокариотических анаэробов (Adams and Stiefel, 1998; Adams, 1999; Silva et al, 2000), получающих энергию только в процессе ферментации. Во-вторых, из него была выделена и очищена мембранно-связанная гидрогеназа (МВН), подобная гидрогеназе 3, части комплекса ФВЛ из Е. coli (Silva et al, 2000; Sapra et al, 2000). Сравнительный анализ гядрогеназ, названных гидрогеназами, подобными гидрогеназе 3 из Е. coli (Kunkel et al, 1998), проведенный в течение последних лет почти одновременно в нескольких лабораториях (Schafer et al., 1996; Ide et al, 1999; Meuer et al, 1999; Sapra et al, 2000; Silva et al, 2000; Friedrich and Scheide, 2000; Poorterand Keltjens, 2001; Zaslavsky and Gennis, 2000; Roth and Hagerhall, 2001; Svetlichnyi et al, 2001; Martinez et al, 2002; Biel et al, 2002) показал, что вес они, возможно, транслоцируют (векторно переносят через мембрану (Nicholls and Ferguson. 1992) протоны и, таким образом, участвуют в дополнительном запасании энергии при ферментации. Однако вопрос, способна ли ФВЛ у Е. coli играть роль генератора энергии в условиях брожения, оставался невыясненным.

Цели и задачи исследований. Основная цель данной работы заключалась в изучении взаимосвязи Н⁺-К⁺-обмена и производства Нг у Е. coli в условиях дефицита энергии при их росте в анаэробных условиях в процессе ферментации глюкозы, протон-транслоцирующей активности гндрогеназ, подобных гидрогеназе 3, компоненты ФВЛ-комплекса Е. coli и энергозапасающей роли ФВЛ, фермента анаэробного брожения. Предполагалось решить следующие задачи: Изучить роль каждого из участников, TrkA, F₀F, и ФВЛ, в формировании мембранного транспортного комплекса с использованием как штаммов Е. coli, несущих мутацию в отдельных субъеднницах этих белковых комплексов, и их делеционных штаммов, так и специфических ингибиторов, блокирующих работу каждого из них по-отдельности.

Идентифицировать источник(и) энергии и охарактеризовать природу восстановительных эквивалентов, участвующих в переносе энергии от F₀Fi Н⁺-АТФазы к TrkA системе поглощения ионов К⁺.

Разработать новый подход для установления механизмов дитиол-дисульфидных взаимопревращений, участвующих в переносе энергии от F₀F| к TrkA с применением штаммов Е. coli с замененными цистеиновыми остатками или делецией F₀F_b а также роли отдельных субъединиц F₀F| в осуществлении акта окислительния - восстановления в процессе внутримембранного взаимодействия.

Изучить действие некоторых физико-химических факторов среды, рН, осмотичности и редокс-потенциала, в регуляции дитиол-дисульфидной реакции, работы отдельных компонентов, F₀F|, TrkA и ФВЛ и активности комплекса, в целом.

і. Исследовать энергозапасающую функцию ФВЛ, фермента анаэробного

брожения, на основе исследования протонтранслоцируюшей функции

гидрогеназы 3. ). Выявить дыхательную роль мембранно-связанноп (МВН) гидрогеназы,

подобной гидрогеназе 3 ФВЛ у Е. coli, из облигатного гипертермофильного

анаэроба P. furiosus. Научная новизна работы. В результате проведенной работы с использованием ингибиторного анализа и широкого набора мутантов накоплен и обобщен новый экспериментальный материал, позволивший попять механизм работы мембранного транспортного комплекса, F_nF| - TrkA - ФВЛ. функционирующего в условиях дефицита энергии при ферментации глюкозы у Е. coli.

Впервые показано, что определяющая роль в процессе функционального объединения отдельных компонентов комплекса принадлежит F₀. части F₀F| Н⁺-АТФазы, м гндрогеназам 3 или 4 - субъединицам ФВЛ.

Установлены доноры энергии (F₀Fi и/или ФВЛ), способы ее передачи (дитиол-дисульфидные взаимопревращения), акцепторы энергии (TrkA) и доноры восстановительных эквивалентов, формирующие механизм транспортного комплекса.

Впервые установлено, что у Е. coli формируются два пути, ФВЛ-1 и ФВЛ-2, ответственных за производство Hi. Экспрессия этих путей и взаимодействие с 2Н⁺-К⁺-обменом, каждого в отдельности, зависит от условий рН (слабокислых или слабощелочных), в которых были выращены бактерии.

Впервые, с использованием мутантов, дефектных по отдельной аминокислоте или несущих ее замену, установлена роль SH-групп каждой из компонент F₀F] в процессе передачи энергии на TrkA. Показано, что замена двух цистеинов, по одному на каждые две копии >-субъединицы F₀ (но не F,), F₍)F] Н⁺-АТФазного комплекса, влияет на осуществление 2Н⁺-К⁺-обмена и производство Н₂.

Описаны механизмы регуляции работы комплекса, осуществляемые за счет редокс- и осмо- модификации профиля SH-групп F₀F,, участвующих во взаимодействии.

На основе экспериментального материала по протонтранслоциругащей активности гидрогеназы 3, компоненты ФВЛ, сравнительного анализа с экспериментальными данными по дыхательной активности мембранно-связанной (MBIT) гидрогеназы, подобной гидрогеназе 3, из P. furiosm, анализа 2Н⁺-К⁺-обмена и выделения Hi и теоретического анализа гидрогеназ, подобных гидрогеназе 3 из Е. coli:

Впервые постулирована энергозапасакэщая функция ФВЛ, фермента анаэробного брожения и его возможное участие в альтернативном фосфорилированпю на субстратном уровне синтезе АТФ по хемиосмотическому механизму.

Впервые установлена способность микроорганизмов с ферментативным типом метаболизма генерировать АТФ в результате производства Н₂, имеющая важное значение не только для понимания эволюции дыхательных систем, но также и возникновения жизни как таковой.

Научно-практическое значение работы. Сделанные в работе выводы и обобщения позволяют по-новому взглянуть на организацию и функционирование бактериальных мембран, что может быть использовано при исследовании мембран эукариотических клеток. Информация, полученная в данной работе, будет использована для углубления понимания механизмов белок-белковых взаимодействий внутри липидного бислоя в мембране, с целью использования их в качестве потенциальных мишеней для имеющихся лекарств и разработки новых антибиотиков для борьбы с бактериальными инфекциями.

Молекулярный водород является важным интермедиатом в деградации органических веществ микроорганизмами, способными получать энергию только за счет ферментативных процессов и использовать водород для того, чтобы избавиться от избытка восстановленных продуктов. Основная часть произведенного Нг используется как аэробными, так и анаэробными пресноводными обитателями для получения богатых энергией восстановительных эквивалентов, которые позволят им восстановить разнообразные субстраты и генерировать достаточно энергии для синтеза АТФ.

Понимание структурных и функциональных особенностей ферментов анаэробного брожения могло бы способствовать созданию устойчивых гидрогеназ для потенциальных биотехнологических целей. В течение последних лет серьезное внимание уделяется поиску и развитию альтернативных источников энергии. Молекулярный водород является в этом отношении идеально чистым топливом. В этой связи гидрогеназы, в том числе и в составе ФВЛ, представляют значительный интерес для их применения в производстве Н₂ и использования в биотехнологии. С другой стороны, детектирование производства Н₂ патогенными микроорганизмами человека может служить важным инструментом для ранней диагностики заболеваний органов желудочно-кишечного тракта. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Формиат-водород-лиаза (ФВЛ) участвует в N,N'-дициклогексилкарбодиимид (ДЦКД)-чувствительном 2Н⁺-К⁺-обмене с фиксированной стехиометрией ионных потоков у выращенных анаэробно и ферментирующих глюкозу Е. coli. В зависимости от условии рН у Е. coli формируются два, ФВЛ-1 и ФВЛ-2, пути.

2. Модулирование сродства F₀F,, TrkA и ФВЛ к их субстратам осуществляется за счет восстановления и окисления тиолов. Редокс-потенциал, осмотичность и рН среды регулируют их профиль в составе мембранных белков. Передача энергии осуществляется за счет дитиол-дисульфидных превращений.

3. ІДистеин (>Cys21) в мембранном домене F₀Fi АТФазы играет ключевую роль в поглощении К⁺ и производстве гЬ.

4. Формнат, окисляемый ФВЛ в условиях анаэробного брожения, может служить донором восстановительных эквивалентов в процессе передачи энергии от F₀Fi к TrkA. Сопряженная с окислением формиата транслокация протонов приводит к генерации Д/іц⁺ - дополнительного источника энергии при формировании мембранного ионного транспортного комплекса.

5. Гидрогеназы, подобные гидрогеназе 3, являются генераторами электрохимического потенциала в условиях дефицита энергии у анаэробных ферментирующих организмов.

Апробация работы. Материалы работы докладывались и обсуждались на 17-ом Международном симпозиуме по биоэлектрохимии и биоэнергетике (Флоренция, Италия, 2003); 6-ом Международном конгрессе Европейской биоэлектромагнитной ассоциации (Будапешт, Венгрия, 2003); 8-й, 9-й и 12-й Европейских биоэнергетических конференциях (Валенсия, Испания, 1994; Лувеп-ля-Нев, Бельгия, 1996; Аркашон, Франция, 2002); 3-ем и 4-ом Европейских биофизических конгрессах (Мюнхен, Германия, 2000; Аликанте, Испания, 2003); Анаэробной Олимпиаде-2002 (Парк Сити, Юта, США, 2002); 43-ем и 46-ом Ежегодных собраниях Американского биофизического общества (Балтимор, Мериленд, США, 1999; Ныо Орлеан, Луизиана, США, 2002); 101-ом и 102-м Общих собраниях Американского микробиологического общества (Орландо, Флорида, 2001; Солт Лейк Сити, Юта, США, 2002); 27-ом Собрании федерации Европейских биохимических обществ (Лиссабон, Португалия, 2001); 18-ом Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Бирмингем, Великобритания, 2000); 13-ом Международном симпозиуме по биоэлектрохимии и биоэнергетике (Йен-Геди, Израиль, 1996); 2-ом Международном симпозиуме, посвященном памяти акад. Н.М. Сисакяна (Дубна, Москва, 2001): конференции, посвященной 30-й годовщине кафедры биофизики ЕГУ (Ереван, 1996), на 20-м Ежегодном собрании Японской биоэнергетической группы (Япония, 1994). Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения (6 глав), заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 259-ти страницах машинописного текста, включая 59 рисунков, 19 таблиц. Список литературы включает 386 названий.

В обзоре литературы приводятся сведения о первичных и вторичных мембранных транспортных системах, принципах их взаимодействия, источниках энергии, обобщаются сведения об анаэробном брожении у бактерий, мембранных ферментах окисления-восстановления, проводятся аналогии с известными эукариотическими и прокариотическими энерго-трансформирующими комплексами.

Краткое содержание остальных глав приводится ниже.