Введение к работе
Актуальность темы. Изучение любой проблемы в области познания механизмов жизнедеятельности обязательно связано с исследованием соответствующих ферментных систем, способных кинетически контролировать химические реакции и осуществлять регуляцию метаболических процессов. Успехи современной теории биологического катализа показали, что ферментативные реакции при всей их сложности протекают в полном соответствші с общими закономерностями обычных химических превращений. Объяснение огромных преимуществ, которыми ферментативный каталш отличается от небиологического гетеро- и гомогенного катализа, заложено фактически в исключительно сложной структуре макромолекулы ферментов и функционн-ровашш их активного центра. Химические группы, формирующие активный центр, как правило, сами по себе являются очень слабыми катализаторами соответствующих реакций, но включение этих группировок в состав полипептидных цепей белковых молекул приводит к появлению такой каталитической активности, которая превышает активность катализаторов небиологического происхождения на несколько порядков.
В настоящее время не существует единой теории, объясняющей необычайно высокую специфичность и активность ферментных катализаторов. В изучении ферментов наиболее актуальными являются такие вопросы, как расшифровка их первичной структуры; влияние различных физико-химических факторов на конформацию белков и связанных с ней механизмов активации и инактивации ферментов; идентификация функциональных групп их каталитических центров; расшифровка молекулярных механизмов катализа. В последние годы особое внимание уделяют амилазам, физико-химические свойства которых были изучены на ранних этапах развития энзимологии, причем их применение в пищевой, легкой промышленности II медицине помогло существенно изменить и усовершенствовать многие существующие технологии и создать новые. Однако кинетико-термодинамические аспекты действия ферментов на полимерные субстраты, а также особенности характера фермент-субстратных взаимодействий на достаточно протяженных участках активных центров амилаз изучены недостаточно.
Результаты многочисленных исследований ингибиторов ферментов, представляющих собой одну из систем регуляции активности клетки и универсальных оперативных систем контроля, а также защиты от собственных амилаз, обусловлены практической необходимостью поиска возможных медицинских препаратов.
Исследование некоторых кинетических аспектов ферментативных реакций в условиях регуляции скорости с помощью различных химических соединений позволяет выяснить, как посредством изменения нормачьных каналов регуляции можно резко повысить эффективность промышленных био-
логических процессов. Большое внимание уделяется изучению взаимодействий ферментов с их оіфужением на молекулярном уровне, но выяснение возможностей использования таких взаимодействий для углубления наших знаний о поведении амилолитических ферментов в природных условиях и для оптимизации соответствующих биокаталитических процессов изучено недостаточно. Исследование особенностей ферментативного катализа иммобилизованными ферментами необходимо для выявления механизмов действия мембранносвязанных ферментов, олигомерных белков и полиферментных систем, сконструированных по модульному принципу, и поэтому различные элементы, необходимые для выполнения биологических функций, объединяются в сложных белках в надмолекулярные комплексы.
Особую значимость приобретают работы по иммобилизации амилаз, обладающих субъединичной структурой, так как носитель может оказывать влияние не только на подвижность отдельных белковых глобул, но и на процесс взаимодействия субъединиц. Результатом изменения конформационной динамики может быть увеличение или уменьшение активности иммобилизо-ваиного фермента, а также изменение избирательности субстрата.
В настоящее время, несмотря на то, что описано большое число иммобилизованных ферментов, нет универсального носителя или общего метода связывания. Дтя иммобилизации определенного биокатализатора нужно выбрать индивидуальный способ фиксации молекулы фермента, учитывая последующее применение полученного препарата не только с точки зрения его каталитических свойств, но также экономической доступности особенно при использовании в промышленности.
Решение многочисленных проблем, связанных с методическими приемами иммобилизации амилаз, подбором носителей, определением кинетико-термодинамических параметров катализа иммобилизованными ферментами является необходимым условием для создания новых технологических разработок, конструирования биореакторов и создания более эффективных гетерогенных биокатализаторов пролонгированного действия для промышленности, медицины и аналитических целей.
Цель и задачи исследования. Основной целью работы является исследование кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза полисахаридов свободными и иммобилизованными амилазами.
Она определяет ряд задач:
изучить структурно-функциональные свойства амилолитических ферментов в условиях различного микроокружения;
исследовать функциональные группы, топографию активных центров и молекулярные механизмы ферментативных реакций гидролиза крахмала и инулина;
разработать эффективные методы иммобилизации амилаз на ионообменных смолах;
рассмотреть влияние иммобилизации на кинетико - термодинамические характеристики реакций гидролнза крахмала и инулина;
изучить стабильность амилолитических ферментов, иммобилизованных на попитах, по отношению к денатурирующим химическим агентам, а также воздействию ультрафиолетового и ионизирующего излучений;
разработать метод определения токсичности зерновых продуктов и комбикормов на основе определения каталитической активности свободной и иммобилизованной глюкоамилазы глюкозооксидазным методом;
определить технологические режимы реакции гидролиза инулина, осуществляемой иммобилизованной инулазой в биореакторах периодического и непрерывного действия.
Научная новизна работы. Впервые разработан модифицированный глу-таральдегидный метод иммобилизации гидролитических ферментов (глюкоамилазы и инулазы) на ионообменных смолах, заключающийся в предварительной обработке носителя янтарным ангидридом, хлористым ацетилом, этилендиамином и глутаровым альдегидом. Показано, что увеличение длины связывающего звена между матрицей и ферментом уменьшает неблагоприятное воздействие химической структуры носителя на конформацию фермента и способствует увелігчению каталитической активности иммобилизованного ферментного препарата. Предложен способ адсорбционной иммобилизации глюкоамилазы на анионите АВ-17-2П, использовавшемся в качестве адсорбента в сахаро-рафинадиом производстве и приобретающем свойства амфотерного ионообменника за счет необратимого поглощения ме-ланоидинов и других продуктов щелочного распада инвертного сахара, выполняющих роль своеобразной подложки в порах ионита.
Впервые установлено, что глюкоамилаза и инулаза имеют четвертичную структуру, состоящую из 2 субъединиц, причем межсубъединичные контакты возникают за счет гидрофобных сил сцепления, и отдельные глобулы обладают каталитической активностью.
Обнаружено, что в процессе ковалентной и адсорбционной иммобилизации амилаз имеет место многоточеченое связывание фермента с носителем, приводящее к увеличению Кт и АН, уменьшению Vmax и AS, а также константы конформациошюго перехода Lo-
Впервые разработаны:
-
экспресс-метод определения токсичности комбикормов и зернопро-дуктов, заражешшх плесневыми грибами, на основе определения кататити-ческой активности свободной и иммобилизованной глюкоамилазы с помощью глюкозооксидазы и пероксидаш, позволяющий количественно регистрировать присутствие микотоксгаюв Ф-2, Т-2, охратоксина А, афлатоксина Bi при концентрации 10" -10 мкг на пробу;
-
схема внутримолекулярных превращений реакции гидролиза инулина и крачмата, осуществляемой глюкоамллазой н инулазой;
3) механизмы функционирования активных центров глюкоамилазы и инулазы;
Научно-практическая значимость работы. Результаты исследования позволяют расширить представление о молекулярных механизмах ферментативного расщепления высокополимерных субстратов, структуре и топографии активных центров глюкоамилазы и шгулазы, кинетико-термодинамических аспектах ферментативного катализа свободными и иммобилизованными амилазами. Полученные в работе данные могут найти применение для модификации носителей при создании сорбентов для аффинной хроматографии, при конструировании биореакторов периодического и непрерывного действия, а также при разработке технологии промышленного получения глюкозы и фруктозы из возобновляемого природного сырья (крахмала и инулина).
Молекулярная модель па основе фермента глюкоамилазы и глюкозоок-сидазного метода используется для определения содержания мнкотоксинов в зернопродуктах и комбикормах (авторское свидетельство № 1641888 А1).
По материалам диссертации изданы 2 учебных пособия, одно из которых с грифом Минвуза РФ, используемые при чтении общих курсов биофизики на биолого-почвешюм факультете Воронежского госуниверситета и Воронежского государственного технического университета.
Апробация работы. Основные результаты исследований, выполненных автором в период 1975 - 1998 гг., докладывались на международных, всесоюзных, республиканских и региональных конференциях. Они были представлены на Международном научно-практическом конгрессе "Экология России" (Москва, 1994), на Международной конференции "Isecos 92" (Воронеж, 1992), II Международном симпозиуме "Молекулярная организация и мобильность полимерных систем" (Санкт-Петербург, 1996), Международной школе "Проблемы теоретической биофизики" (Москва, 1997), Международном симпозиуме "Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах" (Москва-Суздаль, 1995), II Международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (Пущино, 1997), Международном симпозиуме "Математические модели нелинейных возбуждений, переноса, динамики, управления в конденсированных системах и других средах" (Тверь, 1996), Международном симпозиуме "Физико - химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1995, 1998), V Международной конференции "Циклы природы и общества" (Ставрополь, 1997), Международной научной конференции " Геоэкологические проблемы устойчивого развития городской среды" (Воронеж, 1996), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), VII Всесоюзном съезде микробиологического общества (Алма-Ата, 1985), Ш Всесоюзной конференции по проблемам биомеханики (Рига, 1983), VI Всесоюзном симпозиуме "Инженерная этимология" (Вильнюс, 1988), I Всесоюзной конференции "Хроматография в биологии и
медицине" (Москва, 1980), IV Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимических препаратов" (Рига, 1982), IV и VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1981, 1991), Ш Всесоюзной межуниверситетской конференція! по физико-химической биолопш (Тбилиси, 1982), V Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987), Всесоюзной конференции "Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинской промышленности (Москва, 1990), IV и VII Всесоюзной конференции "Иониты" (Воронеж, 1986, 1991), I Всероссийской конференции по фотобиологии (Путино, 1996), VIII Всероссийской конференции "Физико-химігческие основы и практическое применение ионообменных процессов" (Воронеж, 1996), IV Всероссийской конференции "Карбонильные соединения в синтезе гетерониклов" (Саратов, 1996),, И и III Всероссийской конференции по моле-кулярно-клеточным основам кислотного и температурного гомеостаза (Сыктывкар, 1994, 1997), Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств" (Санкт-Петербург, 1996), III и IV межрегиональной конференции "Проблемы химии и химической технологии" (Воронеж, 1995, Тамбов, 1996), Научной конференции "Артериальная пшертензия: клиника и экспериментатъные аспекты" (Санкт-Петербург, 1995), Научно-практической конференции "Мониторинг и охрана окружающей среды ЦЧР" (Воронеж, 1989) и на ежегодных научных конференциях Воронежского госуииверситета.
Публикации, Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 2 учебішх пособиях, 2 авторских свидетельствах и более 60 публикациях.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 269 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка литературы (445 источников) и приложения. Иллюстративный материал включает 122 рисунков и 114 таблиц.