Фотофизические процессы в компонентах нуклеиновых кислот и их комплексах с красителями Рапопорт, Виктор Львович

Введение к работе

Актуальность темы. Облучение живых клеток ультрафиолетовым (УФ) светом вызывает ряд биологических эффектов: фотомутации, канцерогенез, гибель клеток. Первичным актом этих фотобиологических эффектов часто является поглощение света молекулами ДНК. Об этом свидетельствует близость их спектров действия и спектра поглощения ДНК.

После поглощения кванта света в ДНК разворачивается цепочка сначала фотофизических, а затем фотохимических событий, которая заканчивается образованием фотохимического продукта, приводящего к биологическому эффекту. К фотофизическим процессам, кроме поглощения света, относятся люминесценция, миграция энергии возбуждения, перенос заряда, безызлучательные процессы. Образование комплексов ДНК с красителями часто влияет на фотофизические и фотохимические процессы в ней, приводя к появлению новых полос поглощения и сенсибилизации фотоэффекта или, наоборот, к защите ДНК от облучения. Все это определяет актуальность исследования фотофизических процессов в ДНК, ее компонентах и их комплексах с красителями. Тема работы тесно связана с проблемой воздействия ультрафиолетового и видимого излучения на биологические объекты и их защиты от излучений.

Направление работы было сформулировано автором под влиянием идей, работ и чрезвычайно широкого круга научных интересов академика Александра Николаевича Теренина, научного учителя диссертанта.

Несмотря на то, что исследования фотофизических процессов з НК и их комплексах с красителями начались около 30 лет назад, в этой области к началу этой работы (1976 г.) оставалось много важных нерешенных вопросов. Было непонятно: а) почему нуклеиновые кислоты (НК) и их компоненты так слабо люыинесцируют в растворах Сквантовые выходы (Ц?) в воде при комнатной температуре r± Ю^-КГ⁵, а при 77 К в твердых стеклах - (l0"²-I0^-IJ; б) почему спектры возбуждения этой слабой люминесценции часто' сильно отличаются от спектров УФ поглощения тех же растворов (сдвинуты на 3-Ю нм в "красную" сторону); в) почему люминесценция одних красителей при адсорбции на НК сильно "тушится" (про-флавин (ПФ) и акрифлавин (АФЗ, а других - нет Сакридиновый оранжевый (А0)3; г) поглощают кванты УФ света практически невзаимо-

действующие (псевдоизолированные) нуклеиновые основания (НО) в НК или достаточно сильно взаимодействующие для спектральнь проявлений этих взаимодействий (спектры УФ поглощения, КД и минесценции); д) какова природа "красного" смещения спектрої люминесценции ди- и полинуклеотидов относительно тех же спеї ров мономеров.

Это было связано с двумя обстоятельствами. Во-первых, } мономерные компоненты ДНК - нуклеиновые основания и нуклеоті - трудны для фотофизических исследований из-за наличия мноп таутомерных и ионных форм этих молекул, а также близких по ! гии электронных переходов. Во-вторых, в случае полимеров ВСІ дополнительно осложнено межмолекулярными взаимодействиями.

Основные исследования, предшествующие этой работе, бьоп проведены при 77 К, и имелись лишь немногочисленные работы і люминесценции при комнатной температуре.

Понимание фотофизических процессов в ДНК и ее компонен¹ до сих пор значительно отстает от понимания подобных процес в хорошо люминесцирующих белках и хлорофилле.

Целью работы явилось исследование фотофизических проце поглощения света, люминесценции, переноса заряда и безызлуч тельных переходов в простых системах, моделирующих ДНК и ее комплексы с красителями, и изучение влияния на эти процессы межмолекулярных взаимодействий.

Объектами исследования служили нуклеиновые основания, леотиды, гомогенные динуклеотиды, динуклеозидфосфаты и неко рые полинуклеотиды, комплексы НО и нуклеотидов с акридиновы красителями (Ж\ хинонами и иодом, агрегаты АК и фталоциани магния (Фц Мо).

В случае моноыерных компонентов НК исследовалось влияк на фотофизические процессы взаимодействия с растворителем к молекулами красителей. Динуклеотиды и полинуклеотиды являют простыми модельными системами для изучения "вертикальных" ( почных") взаимодействий между НО в ДНК и их влияния на фоте зические процессы.

Большая часть исследований проведена в водных растворг при 293 К и в водно-этиленгликолевых Or:HgO) стеклах при *; Часть исследований (агрегация красителей) проведена в вакуз условиях.

В работе были поставлены следующие основные задачи.. . Для мономзрных компонентов НК:

1. исследование природы различия спектров поглощения и возбуждения люминесценции;

2. исследование.связи между структурой и люминесцентной способностью пуриновых..компонентов.

Для комплексов-мономерных.компонентов НК с красителями:

3. исследование способности компонентов НК к образованию комплексов с переносом заряда (КПЗ) с электроноакцепторными молекулами и выяснение природы.донорной способности компонентов НК С/Ґ - или In -доноры?);

4. исследование комплексообразования ыономерных компонентов НК и их аналогов с акридиновыми красителями и его влияния на люминесценцию красителей.

Для динуклеотидов и псдинуклеотидов:

5. обнаружение и исследование экситонных эффектов в спектрах поглощения и люминесценции и их сопоставление с аналогичными эффектами в агрегатах красителей;

6. уточнение модели первичных фотопроцессов в немономер-ных компонентах НК (эксимер или экстонное расщепление?).

Основными .методами исследования являлись метод электронного поглощения и люминесцентный..Исследовались спектры флуоресценции и фосфоресценции, их возбуждения, квантовые выходы, в некоторых случаях степень поляризации люминесценции (Р). Было собрано несколько люминесцентных установок,.в том числе высокочувствительная для регистрации спектров испускания, и возбуждения слабой люминесценции .компонентов НК по счету фотонов. Кроме того, в последние годы использовался, высококлассный спектро-флуориметр "Хитачи-850^п (Япония) с автоматической коррекцией спектров, снабженный мини-ЭВМ.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые проведено комплексное и систематическое исследование основных фотопроцессов в мономерных компонентах НК, их комплексах с красителями, в ди- и полинуклеотидах при изменении в широких пределах условий эксперимента (концентрация. , значения рН, длина волны возбуждения и регистрации). Впервые систематически исследованы спектры возбуждения люминесценции компонентов НК, оказавшиеся очень информативными из-за гетерогенности изученных

- 4 -растворов и сильной зависимости люминесцентной способности ко понентов НК от небольших изменений в их структуре. В результате выполнения работы:

7. показано, что различия спектров поглощения и возбужде ния люминесценции мономерных компонентов НК обязаны не наруше нию закона Вавилова, а люминесценции редких форм молекул (тау меры, ионные формы, агрегаты и молекулы в редкой ферме гидрат ции) с относительно высоким квантовым выходом;

8. выявлена определяющая роль водородных связей с раство рителем в тушении флуоресценции основных нейтральных форм ци-тозиновых и адениновых мономерных компонентов НК. Для аденина и его производных предложена модель тушения люминесценции ЦИК лической водородной связью между аминогруппой и атомом Ыу через -ОН группу растворителя, объясняющая зависимость люминє центной способности от структуры молекулы;

9. показано, что мономерные компоненты НК способны образ вывать КПЗ с электроноакцепторнымк молекулами, выступая в род <1Ґ -доноров электрона;

10. показано, что для некоторых конформеров ди- и полинуї леотидов характерны экситонные спектры поглощения с расщеплением л/ 3000 см , соответствующие "консервативным" спектрам кругового дихроизма. Предложена экситон-эксимерная модель пщ. вичных фотопроцессов в ди- и полинуклеотидах вместо ранее пр* нятой . эксимерной.

Научная и практическая ценность работы состоит в возможности использования ее результатов в таких областях науки, кг биофизика, фотобиология и спектроскопия биологических молеку; Обнаружение эффективного тушения возбужденных состояний компс нентов НК водородными связями с растворителем и, в частности, циклическими водородными связями, позволяет наметить новые щ ти решения проблемы защиты биологических объектов от поражающего действия ультрафиолетового излучения. Обнаружение "экси-тонных конформеров" ди- и полинуклеотидов'уточняет описание і вичных фотопроцессов в НК и дает возможность нового объяснен! различий спектров действия фотобиологических эффектов и спею ров поглощения ДНК.

Апробация результатов и публикации. Результаты диссертации доложены на Симпозиуме стран СЭВ по биофизике нуклеиновш

кислот и нуклеопротеидов (Таллин, 1981), Ш Конгрессе Европейского фотобиологического общества (Будапешт, 1989) и всесоюзных конференциях и совещаниях; по физике жидкого состояния вещества (Самарканд, 1974), по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1974, 1977, 1984, 1987), по люминесценции (Минск, 1977 и Самарканд, 1979), по молекулярной люминесценции и ее применениям (Харьков, 1982), по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Телави, 1980), биофизическом съезде (Москва, 1982), "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение" (Рига, 1981, 1983, 1985), сессии секции кристаллохимии по проблеме: "Структурные аспекты биологической активности" Шущино, 1986), "Биофизика рака" (Черноголовка, 1987), всесоюзной школе-семинаре по биомолекулярному компьютингу (Москва, 1991), всесоюзном семинаре "Фотоника нуклеиновых кислот" (Ленинград, 1978-1988), семинаре оптического отдела им.Г.С.Ландсберга ФИ им.П.Н.Лебедева РАН (1991). Основное содержание диссертации опубликовано в 22 статьях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести разделов и заключения, содержит ИЗ рисунков, б таблиц и список литературы, включающий 256 наименований -всего 313 страниц.

Личный вклад автора. Содержание диссертации отражает личный вклад автора в опубликованные работы. Основная часть работ выполнена в соавторстве с учениками. Автору принадлежит выбор направления ис следования, постановка задач, планирование эксперимента, участие в конструировании аппаратуры* ее сборке и проведении экспериментов, интерпретация результатов.

- б -