Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор
1.1 Введение: ретинальсодержащие белки архебактерий
1.2 Структуры сенсорного родопсина 1 и сенсорного родопсина 2 13
1.3 Фотоциклы сенсорных родопсинов 16
1.4. Структура транедьюсеров сенсорных родопсинов 18
1.5 Структура и функции комплексов сенсорных родопсинов и их галобактериальных транедьюсеров 23
1.6 Представление о молекулярных механизмах передачи сигнала 27
1.7 Заключение 30
Глава 2. Материалы и методы 31
2.1. Оборудование и материалы 31
2.1.1. Оборудование 31
2.1.2. Материалы и химические реагенты 33
2.1.3. Буферы и растворы 34
2.2. Клонирование и работа с Е.coli
2.2.1. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы 37
2.2.2. Методы клонирования и работы с E.coli 39
2.3. Очистка и приготовление образцов белка 46
2.3.1. Выделение и очистка белков 46
2.3.2. Анализ качества рекомбинантных белков 49
2.3.3. Реконструкция сенсорных родопсинов 1 и 2 и совместная реконструкция сенсорного родопсина 1 и его транедьюсера в липидные мембраны 52
2.4. Спектроскопические методы 55
2.4.1. Измерение спектров поглощения в ультрафиолетовой и видимой области 55
3 Photo laxis in H.salinarum
2.4.2 Измерение времени жизни переходного состояния СРІ373 55
2.4.3 Лазерный импульсный фотолизис 56
2.4.4. Рамановская спектроскопия 57
Глава 3. Картирование региона взаимодействий между сенсорным родопсином 1 и его галобактсриальным трансдыосером 60
3.1. Клонирование, экспрессия и очистка и реконструкция архебактериальных белков 61
3.1.1. Основы клонирования, экспрессии и очистки сенсорного родопсинов из H.salinarum и их трансдьюсеров 61
3.1.2. Клонирование, экспрессия и очистка сенсорного родопсина 1 64
3.1.3. Анализ рекомбинантного сенсорного родопсина 1 66
3.1.4. Клонирование, экспрессия и очистка галобактериального трансдьюсера 1 67
3.1.5. Клонирование, экспрессия и очистка делеционных мутантов галобактериального трансдьюсера 1 69
3.2. Реконструкция сенсорных родопсинов и их комплексов с галобактериальными трансдьюсерами в полярные липиды 70
3.3. Кинетика возращения основного состояния сенсорного родопсина 1 в полярных липидах пурпурных мембран H.salinarum 73
3.4. Исследование взаимодействия сенсорного родопсина 1 с укороченными трансдьюсерами, полученными из очищенных компонентов, после совместной реконструкции в полярные липиды пурпурных мембран 74
3.5. Получение химерных белков, состоящих из сенсорного родопсина 1 и его укороченных трансдьгосеров, и иследование кинетики возращения основного состояния СР1 в мембранах E.coli. 79
3.5.1. Клонирование и экспрессия химерных белков сенсорного родопсина 1 и делеционных мутантов галобактериального трансдьюсера I 81
3.5.2. Кинетика возращения основного состояния гибридных белков, состоящих из сенсорного родопсина 1 и его укороченных трансдьюсеров, в мембранах E.coli 83
3.6. Возможное объяснение механизма (не)зависимости времени распада М-состояния комплексов сенсорного родопсина 1 от рН 84
3.7. Основные результаты 88
Глава 4. Функциональная характеризация сенсорного родопсина 2 из Halobacterium salinarum, экспрессированного в E.coli 90
4.1. Клонирование, экспрессия и очистка сенсорного родопсина 2 90
4.2. Анализ рекомбинантного сенсорного родопсина 2 93
4.2.1. Анализ качества белка методами ДСН гель-электрофореза и иммуноблотинга 93
4.2.2. ESI масс-спектрометрия 94
4.3. Биофизический анализ (фотохимический анализ) 98
4.3.1. UV/Vis спектроскопия 98
4.3.2. Рамановская спектроскопия 100
4.3.3. Лазерный импульсный фотолизис 105
4.4. Основные результаты 109
Список использованной литературы 113
Благодарности 122
- Структура и функции комплексов сенсорных родопсинов и их галобактериальных транедьюсеров
- Реконструкция сенсорных родопсинов 1 и 2 и совместная реконструкция сенсорного родопсина 1 и его транедьюсера в липидные мембраны
- Клонирование, экспрессия и очистка делеционных мутантов галобактериального трансдьюсера 1
- Анализ качества белка методами ДСН гель-электрофореза и иммуноблотинга
Введение к работе
Глава 1. Литературный обзор
1.1 Введение: ретинальсодержащие белки архебактерий
Структуры сенсорного родопсина 1 и сенсорного родопсина 2 13
Фотоциклы сенсорных родопсинов 16 1.4. Структура транедьюсеров сенсорных родопсинов 18
Структура и функции комплексов сенсорных родопсинов и их галобактериальных транедьюсеров 23
Представление о молекулярных механизмах передачи сигнала 27
1.7 Заключение 30 Глава 2. Материалы и методы 31
2.1. Оборудование и материалы 31
Оборудование 31
Материалы и химические реагенты 33
Буферы и растворы 34
2.2. Клонирование и работа с Е.coli Ъ1
Бактериальные штаммы и плазмидные векторы 37
Методы клонирования и работы с E.coli 39
2.3. Очистка и приготовление образцов белка 46
Выделение и очистка белков 46
Анализ качества рекомбинантных белков 49
Реконструкция сенсорных родопсинов 1 и 2 и совместная реконструкция сенсорного родопсина 1 и его транедьюсера в липидные мембраны 52
2.4. Спектроскопические методы 55 2.4.1. Измерение спектров поглощения в ультрафиолетовой и видимой области 55
3 Photo laxis in H.salinarum
Измерение времени жизни переходного состояния СРІ373 55
Лазерный импульсный фотолизис 56 2.4.4. Рамановская спектроскопия 57 Глава 3. Картирование региона взаимодействий между сенсорным родопсином 1 и его галобактсриальным трансдыосером 60
3.1. Клонирование, экспрессия и очистка и реконструкция архебактериальных белков 61
Основы клонирования, экспрессии и очистки сенсорного родопсинов из H.salinarum и их трансдьюсеров 61
Клонирование, экспрессия и очистка сенсорного родопсина 1 64
Анализ рекомбинантного сенсорного родопсина 1 66
Клонирование, экспрессия и очистка галобактериального трансдьюсера 1 67
Клонирование, экспрессия и очистка делеционных мутантов галобактериального трансдьюсера 1 69
Реконструкция сенсорных родопсинов и их комплексов с галобактериальными трансдьюсерами в полярные липиды 70
Кинетика возращения основного состояния сенсорного родопсина 1 в полярных липидах пурпурных мембран H.salinarum 73
Исследование взаимодействия сенсорного родопсина 1 с укороченными трансдьюсерами, полученными из очищенных компонентов, после совместной реконструкции в полярные липиды пурпурных мембран 74
Получение химерных белков, состоящих из сенсорного родопсина 1 и его укороченных трансдьгосеров, и иследование кинетики возращения основного состояния СР1 в мембранах E.coli. 79
4 Phototaxis in H.salinanim
Клонирование и экспрессия химерных белков сенсорного родопсина 1 и делеционных мутантов галобактериального трансдьюсера I 81
Кинетика возращения основного состояния гибридных белков, состоящих из сенсорного родопсина 1 и его укороченных трансдьюсеров, в мембранах E.coli 83
3.6. Возможное объяснение механизма (не)зависимости времени распада М-состояния комплексов сенсорного родопсина 1 от рН 84
3.7. Основные результаты 88 Глава 4. Функциональная характеризация сенсорного родопсина 2 изHalobacterium salinarum, экспрессированного в E.coli 90
Клонирование, экспрессия и очистка сенсорного родопсина 2 90
Анализ рекомбинантного сенсорного родопсина 2 93
Анализ качества белка методами ДСН гель-электрофореза и иммуноблотинга 93 ESI масс-спектрометрия 94
4.3. Биофизический анализ (фотохимический анализ) 98 UV/Vis спектроскопия 98
Рамановская спектроскопия 100
Лазерный импульсный фотолизис 105
4.4. Основные результаты 109 Выводы 111 Список использованной литературы 113 Благодарности 122
5 Phototaxis in H.salinarum
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
6 Photo taxis in H. sal і n arum
ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы.
Последнее время всё большее внимание уделяется проблемам белок-белковых взаимодействий. Передача сигнала в клетке является одним из важных и интересных примеров подобных взаимодействий. Как природа сигнала, так и механизм его передачи могут различаться, но, безусловно, имеются особенности, общие для многих организмов.
Многие важные клеточные рецепторы являются мембранными белками. Данная работа посвящена сенсорным родопсинам 1 и 2, а также их трансдыосерам из Halobacterhim salinarum (устаревшее название — Halobacterium halobium). Сенсорные родопсины 1 и 2 являются белками-рецепторами и отвечают за фототаксис. Они представляют собой 7 трансмембранных спиралей с относительно короткими линкерными участками и хромофором ретиналем, соединенным с белком через основание Шиффа. Дополнительную значимость исследованию этих белков придает их структурное и функциональное сходство со зрительными пигментами животных - родопсинами.
Сенсорный родопсин 2 (СР2, часто называемый фобородопсином) ответственен за отрицательный фототаксис и синтезируется клеткой в нормальных условиях, когда кислорода и питательных веществ достаточно для осуществления аэробного дыхания. При этом бактерии стремятся покинуть освещенные области во избежание возможного повреждения ДНК путем фотоокисления. Максимум поглощения СР2 приходится на максимум солнечного спектра на поверхности Земли, что позволяет бактериям максимально эффективно осуществлять поиск затененных областей.
В отличие от фобородопсина, который служит лишь рецептором-репеллентом, СР1 выполняет более сложные функции - определяет положительный ответ клетки на оранжевый свет (функция рецептора-аттрактанта) и отрицательный на свет фиолетовой области (функция рецептора-репеллента). Тем самым СР1 играет важную роль в регуляции
7 Phototaxis in H.salinarum жизненного цикла бактерии: он является частью сложной машинерии клетки, отвечающей за автотрофное питание организма в отсутствие поступления достаточного количества питательных веществ извне.
Передача сигнала с рецептора на флагеллярный мотор архебактерии осуществляется не на прямую, а через каскад киназ при помощи специального белка-трансдьюсера (Гтр), ассоциированного в мембранной части с рецептором. Структурно галобактериальньтй трансдьюсер (Гтр) — это 2 трансмембранных спирали и длинный цитоплазматичсский домен с участками метилирования. Гтр2 имеет интересную особенность, отличающую его от других трансдьюсеров: периплазматический домен, позволяющий ему функционировать как хеморецептору. Трансдьюсеры сенсорных родопсинов архебактерии высоко гомологичны хеморецепторам эубактерий, представляя, тем самым, особый интерес для исследователей как эволюционно родственные белки.
Исследования этих рецепторов самих по себе или в комплексе с соответствующими трасдьюсерами позволит больше узнать о связи структуры и функции гомологичных белков, углубить понимание механизмов фото- и хемотаксиса, а также эволюции механизмов передачи сигнала в клетках вообще и эволюции рецепторов в частности.
Цели и задачи.
СР2 - один из наименее исследованных ретинальных белков архебактерии. Хотя он был обнаружен в 1986 году, наши познания ограничены лишь некоторыми особенностями его фотофизиологии на основании спектроскопических данных. Причиной тому является его нестабильность и, следовательно, невозможность получить необходимые для исследований количества белка. Решению этой проблемы и посвящена первая часть данной работы. Было решено найти стабильную систему экспрессии в системе Escherichia со И, разработать эффективную методику
8 Phototaxis in H.salinarum очистки и более подробно охарактеризовать данный белок как в детергенте, так и в близком к нативному окружении.
Целью второй части работы было изучение природы взаимодействия между СР1 и его белком-партнером — Гтрі. Первоначальной задачей было нахождение оптимальных условий экспрессии и очистки рецептора и трансдьюсера. Затем требовалось разработать метод совместной реконструкции СР1 самого по себе и с трансдьюсером. Наконец, было необходимо прокартировать регион взаимодействия между этими белками и найти минимальный по длине цитоплазматической части, но все еще взаимодействующий с СР1 трансдыосер.
Научная новизна.
Достигнута функциональная экспрессия СР2 из Halobacterium salinarum в клетках Escherichia col і, разработана эффективная методика его очистки и реконструкции в липидные мембраны. Это дало возможность исследовать фотохимические свойства фобородопсина в разном окружении. Впервые получен рамановский спектр СР2 в липидном окружении, дающий ценную информацию об особенностях структуры его хромофора.
Хотя методы экспрессии и очистки СР1 были опубликованы ранее, они не удовлетворяли требованиям к качеству белка и были существенно модифицированы, что повысило чистоту рекомбинантного СР1. То же относится к полноразмерному Гтрі и его делеционным мутантам: вместо экспрессии в H.salinarum была разработана система экспрессии в E.coli и последующей очистки рекомбинантных трансдьюсеров.
Впервые проведена успешная реконструкция СР1 в мембраны полярных липидов пурпурных мебран H.salinarum, а также совместная реконструкция рецептора и делеционных мутантов трансдьюсера из отдельных очищенных компонентов. Проведено полное ступенчатое картирование цитогшазматической части Гтрі от 147 до 52 аминокислотного остатка — завершающего вторую трансмембранную спираль в трансдьюсере -
9 Phototaxis in H.salinarum в полярных липидах пурпурных мембран H.salinarum. Проанализировано влияние делеционных мутантов трансдьюсера на фотоцикл сенсорного родопсина 1.
Кроме того, созданы химерные белки, состоящие из СР1 и Гтрі длиной 52, 71 и 147 аминокислотных остатков, а также химерный белок, состоящий из СР1 и цитоплазматического участка Гтрі между 53 и 147 аминокислотными остатками. Проверена функциональность данных конструкций. Установлены важные различия в фотохимическом поведении СР1 и Гтрі после совместной реконструкции в мембраны полярных липидов пурпурных мебран H.salinarum и химерных белков СР1+Гтр1 в нативных мембранах E.colL
10 Phototaxis in H.salinarum
Структура и функции комплексов сенсорных родопсинов и их галобактериальных транедьюсеров
То, что рецепторы и их трансдьюсеры физически ассоциированы в мембране, было известно сравнительно давно [35;38;53;54]. Однако только недавно была определена стехиометрия комплекса СРІ.ТтрІ, равная 2:2 [55] и подтверждена специфичность взаимодействия между рецептором и его транс дьюсером.
В отсутствие трансдьюсера СР1 и, в меньшей степени, СР2 функционируют как протонные насосы, переносящие Н+ из клетки наружу. Это было показано при освещении суспензии везикул, содержащих рецептор, или клеток H.salinarum мутантного штамма с делецией генов остальных 3-х архейных родопсинов и гена htrl или Ыг2 - в обоих случаях внешняя среда закислялась [56-58]. Позже данное свойство СР1 было подверждено более точными измерениями фототока в реконструированных образцах [59], а также потенциала смычки мембран ооцитов лягушек Xenopus после инъекции в них мРНК гена sopl [60].
Как следствие более медленного фотоцикла, эффективность переноса протонов СР1 значительно ниже, чем у БР и ГР [61]. Наибольшая разница между фотоциклами ионных насосов и рецепторов состоит в том, что релаксация М-состояния у рецепторов происходит медленнее, в то время как его образование протекает практически с одинаковой скоростью. Эта точка зрения косвенно подтверждается результатами компьютерного выравнивания аминокислотных последовательностей. В БР ключевую роль в переносе протона играют два остатка аспарагиновой кислоты, Asp85 и Asp96: первый является акцептором ЬҐ при депротонированиии основания Шиффа в М-состоянии, второй, наоборот, играет роль донора при репротонировании основания Шиффа со стороны цитоплазматического канала, таким образом, завершая векторный перенос протона через мембрану [62]. У сенсорных родопсинов Asp96 заменен на ароматический остаток — тирозин (Туг87 для CP1 и Tyr84 для CP2), что существенно замедляет репротонирование основания Шиффа и увеличивает время жизни М-со стояния. Связывание Гтр2 из H.salinarum с соответствующим рецептором незначительно удлиняет время жизни О-состояния СР2 в комплексе с трансдьюсєром [54]. Интересно, что поведение высокогомологичного СР2 из N.pharaonis вообще не меняется в присутствии его трансдюсера [63].
Напротив, скорость релаксации СР373 в отсутствие Гтрі экспоненциально зависит от рН, в то время как скорость релаксации сигнального состояния комплекса постоянна в широком диапазоне рН [64]. Авторы работы объясняют наблюдаемый эффект тем, что Гтрі специфически блокирует канал переноса протона при связывании с СР1, В 1999 году Юнг с соавторами (Jung К..-Н. et al.) предположили, что Гтрі модулирует фотокинетику СР1, облегчая депротонирование и протонирование Шиффова основания [65]. Эти наблюдения подтвердились и в экспериментах с использованием потенциала смычки на ооцитах Xenopus [60]. Однако возможно и другое объяснение: дело в том, что основное состояние СР1 является на самом деле равновесной смесью двух форм: «нормальной» СР587 и щелочной СР550 (рКа=7.4 [56]), и прокачка протонов осуществляется исключительно второй формой [56]. Если связывание трансдьюсера сдвигает равновесие в сторону СР587 (при этом рКа сдвигается до 8.5 [66]), то фототок исчезает. Важно, что при этом закрытия канала переноса протона может и не происходить. Естественно, два приведенных объяснения не являются взимоисключающими.
Результаты, накопленные за последнее время, указывают на важную роль т.н. области передачи сигнала, имеющей длину около 90 аминокислотных остатков и примыкающей к цитоплазматическому концу трансмембранной спирали 2. Эта область, как следует из названия, вовлечена в передачу сигнала от рецептора к киназам, что подтверждается сильной зависимостью времени жизни сигнального состояния СР1 СР373 от природы семи аминокислотных остатков в Гтрі H.salinarum (расположенных между
Glu56 и Glul08 включительно) [67]. Кроме того, ранее считалось, что остатки 1-147, включающие в себя 2 трасмембранных спирали и область передачи сигнала, существенны для сохранения фотоцикла СР1 дикого типа, который значительно изменяется в отсутствие Гтр! [68]. Та же группа через 8 лет опровергла свои же данные, показав, что двух трансмембранных спиралей Гтрі достаточно для модулирования фотоцикла рецептора [69]. Наконец, совсем недавно ими была опубликована третья работа, в которой экспрессируемыи в клетках H.salinarum химерный белок СР1-Гтр61 оказался нечувствительным к изменению внешнего рН, в то время как химерный белок, состоящий из рецептора и двух трансмембранных спиралей трансдьюсера, не способствовал сохранению нативного фотоцикла СР1 [70]. Поэтому в настоящее время считается, что 13 прилегающих к мембране аминокислотных остаков достаточно для закрывания цитоплазматического канала рецептора.
Аминокислотные остатки, входящие в состав области передачи сигнала, довольно консервативны для всех архебактериальных трансдьюсеров. 9 из этих остатков являются общими для многих организмов: различных видов архебактерий, E.coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis и Enterobacter aerogenes (рис. 1.7). В этой связи нельзя не упомянуть замечательную работу Юнга с соавторами (Jung К.-Н. et al.): группе ученых генноинженерными методами удалось создать единую конструкцию из рецептора СР2 N.pharaonis с собственным мутантным трансдьюсером, у которого почти весь цитоплазматический домен был заменен на цитоплазматический домен аспартатного или серинового рецептора из E.coli, ответственных за хемотаксис [71]. В результате успешной экспрессии таких сложных генов получался функциональный химерный белок, а клетки E.coli приобретали способность к фототаксису, повторяя поведение N.pharaonis при тех же условиях
Реконструкция сенсорных родопсинов 1 и 2 и совместная реконструкция сенсорного родопсина 1 и его транедьюсера в липидные мембраны
Полярные липиды из пурпурных мембран выделяли по методике, разработанной Кейтсом [85], с небольшими изменениями.
Пурпурные мембраны, содержащие 300-350 мг бактериородопсина, ресуспендировали в 200 мл 4 М NaCI. К этой суспензии добавляли 750 мл смеси метанола и хлороформа (2:1, об/об). Получившуюся суспензию оставляли перемешиваться в темноте в течение 4 час при комнатной температуре в инертной атмосфере азота. После осаждения нераствор ившихся мембран (10 000 g) процедуру растворения липидов в органических растворителях повторяли снова. Супернатанты после осаждения объединяли и фильтровали. Затем к ним добавляли водный раствор хлороформа (1:1, об/об) и тщательно перемешивали. Органическую фазу концентрировали в роторном испарителе до почти сухого состояния при температуре не выше +30С и растворяли в 10 мл хлороформа. Нерастворившиеся частицы удаляли центрифугированием (12 000 g) при +4С.
Для разделения полярных и неполярных липидов к суспензии добавляли 45 мл охлажденного ацетона и ресуспендировали в ультразвуковой бане. После добавления 1 мл раствора метанола : MgCb (9:1, об/вес), супернатант, содержащий неполярные липиды, отделяли центрифугированием и. Эту процедуру повторяли несколько раз, пока супернатант не становился бесцветным. Осадок после последнего центрифугирования высушивали под вакуумом и растворяли в смеси метанол : хлороформ (1:1, об/об) до концентрации 40 мг/мл. Полученный раствор растворяли в 20-кратном избытке 50 мМ фосфатного буфера, рН 8.0 в темноте в инертной атмосфере аргона. Полученную суспензию полярных липидов гомогенизировали в ультразвуковой ванне в течение нескольких минут, а затем снова высушивали под вакуумом. Сухие липиды растворяли в необходимом буфере и хранили в виде аликвот при -80С.
Для реконструкции СР1 или СР2 в полярные липиды белок с концентрацией около 1 мг/мл в 4 М NaCl, 50 мМ MES рН 6.0, 0.05% ДМ смешивали с равным объемом полярных липидов из пурпурных мембран Н. salinarum, так, чтобы отношение количества вещества липидов к общему количеству вещества белка (т.н. липидное число) было равно 50-60, с концентрацией 0.5 мг/мл в 50 мМ MES рН 6.0. Получившуюся смесь оставляли перемешиваться на 1 час в темноте при +4С, затем добавляли смолу BioBeads SM2 (Bio-Rad, США) до концентрации 50 мг/мл для удаления детергента и оставляли на 14-16 час при +4С при постоянном перемешивании. От BioBeads SM2 избавлялись, отбирая раствор тонким капилляром, и реконструированный белок осаждали центрифугированием при 7 500 g в течение 10 мин при +4С. Супернатант удаляли, а окрашенный осадок, содержащий мембранную фракцию, ресуспендировали в требуемом буфере. Готовые образцы хранили при +4С.
Очищенный СР1 с концентрацией 1 мг/мл, в 4 М NaCI, 50 мМ MES рН 6.0, 0.05% ДМ инкубировали с двукратным молярным избытком транедъюсера в 2 М NaCI, 50 мМ MES рН 6.0, 0.05% ДМ при +4С в течение часа. Затем добавляли ПЛПМ (2 мг/мл, 50 мМ MES рН 6.0) так, чтобы, липидное число также было равно 50-60, и оставляли при постоянном перемешивании в течение часа. После этого к раствору добавляли смолу BioBeads SM2 до концентрации 50 мг/мл для удаления детергента и оставляли на 14-16 час при +4С при постоянном перемешивании. От BioBeads SM2 избавлялись, отбирая раствор тонким капилляром, и реконструированный белок осаждали центрифугированием при 7 500 g в течение 10 мин при +4С. Супернатант удаляли, а окрашенный осадок, содержащий мембранную фракцию, ресуспендировали в требуемом буфере. Готовые образцы хранили при +4 С.
Все спектры поглощения сенсорных родопсинов измеряли на спектрофотометре Shimadzu UV-2104PC (Япония). Спектрофотометр состоит из источника света, дисперсионного элемента, который отбирает длины волн для облучения образца, и детектора. В Shimadzu UV-2401PC в качестве источников света используются дейтериевая и галогеновая лампы, а роль дисперсионного элемента играет вращаемая дифракционная решетка. Образец помещался между источником света и детектором. В одну кварцевую кювету с длиной пути 1-Ю мм наливали образец, а в другую -буфер сравнения. При измерении солюбилизированного в детергенте белка использовали стандартную камеру и кварцевые кюветы. Спектры поглощения реконструированных сенсорных родопсинов или их комплексов измеряли в камере с интегрирующей сферой для учета рассеяния от липидов.
Клонирование, экспрессия и очистка делеционных мутантов галобактериального трансдьюсера 1
Для конструирования укороченных генов htrl использовали 5 -праймер HTRI B/Nde Strep, создающий Nde\ сайт и олигонуклеотид для strepagll (10 дополнительных аминокислотных остатков) после стартового кодона. Различные З -праймеры, содержащие НітШІ сайт рестрикции позади стоп- кодона и регион, кодирующий последнюю желаемую аминокислоту перед стоп-кодоном были использованы для амплификации с помощью ПЦР. Полученный делетированный белок (структура N-конца: MASWSHPQFEKJ1AW...) назывался StrepTTp... плюс номер последней аминокислоты в гене дикого типа (рис. 3.6.). Созданные гены были вставлены в разрезанный по Ndel/Hindlll вектор pET 27Ь+. Чтобы исключить возможное влияние strepag II на свойства трансдьюсера, также была создана аналогичная конструкция с таким же олигопептидом, но на С-конце белка, названная по такому же образцу vp52-Strep. Этот фрагмент ДНК был заклонирован в рЕТ Па. Экспрессию генов делеционных мутантов проводили аналогично экспрессии гена полноразмерному белка. Экспрессированные белки мщ г з очищали по аналогии с полноразмерным Ттрі-Strep, т.е. солюбилизировали ЯН мембранную фракцию разрушенных при пропускании через пресс Френча клеток в 2% (вес/об) ДМ, а затем супернатант наносили на стрептактиновую колонку.
После промывания буфером для нанесения, белок элюировали 2.5 мМ Рис. 3.7. Гель-электрофореграмма дистиобиотина. Выход очищенных очищенных: , _ БігерГтр12А, 2 -делеционных мутантов Гтрі был около ЛгерГтрІЗб и 3-&ге/?Гтр147. 0.6-0.8 мг/л клеточной культуры. На рис 3.7. представлена электрофореграмма очищенных мутантов 5УгерГтр124, StrepTip 136 и StrepFrp 147. Делеционные мутанты Гтрі стабильны в течение недели при хранение на +4С. Для дальнейшей работы был использован только свежеочищенный белок. Для исследования свойств сенсорных родопсинов в окружении, близком к нативному, белки реконструировали в полярные липиды пурпурных мембран. Термин «реконструкция» означает замену детергента, необходимого для солюбилизации и дальнейшей очистки белка, на липидное окружение. Смола BioBeads SM2 (Bio-Rad, США) представляет собой мелкие шарики, сделанные из сшитого поливинилбешола и имеющие поры диаметром около 90 А. При смешивании солюбилизированного белка с липидами гидрофобные молекулы детергента абсорбируются на неполярных стенках пор. Из-за маленького диаметра пор шарики могут избирательно поглощать только свободные мономеры детергента, т.к. белковые мицеллы и липосомы слишком велики для них [90].
Схематически этот процесс изображен на рис 3.8. Рецептор в растворе детергента смешивали с ПЛПМ при рН 6.0, поскольку СР1 наиболее стабилен при данном рН. Детергент удаляли, инкубируя раствор белка с BioBeads SM2 в течение ночи при +4С. Реконструированный белок осаждали центрифугированием. Осадок, содержащий мембранную фракцию, ресуспендировали в требуемом буфере. Переход белка из детергента в липиды легко отслеживался с помощью центрифугирования: окрашенный белок полностью оставался в мембранной фракции, а супернатант становился бесцветным. Анализ фракций супернатанта и липидного осадка на гель-электрофорезе в ДСН выявил, что белки были исключительно в мембранной фракции, состоящей из осажденных мембран (рис 3.9.). Более чем 80% изначально взятого сенсорного родопсина 1 успешно встраивалось в ПЛПМ, как было определено по поглощению на 587 нм. К сожалению, оценка качества реконструированного белка была затруднена из-за сильного фонового рассеяния липидов на 280 нм.
Анализ качества белка методами ДСН гель-электрофореза и иммуноблотинга
Термин «иммуноблоттинг» применяют к процедуре иммобилизации белков на твердой подложке (мембране) после гель-электрофореза в ДСН для последующего анализа на специфические последовательности. Все белки, используемые в работе, содержали определенную пептидную последовательность (hisag или strepaglT), поэтому для идентификации исследуемого белка в клеточном лизате или подтверждения наличия димеров использовались коньюгаты антител, специфичные к этим последовательностям. Анализ качества рекомбинантного СР2 с помощью гель электрофореза в ДСН выявил высокую гомогенность белка после очистки - 80-90%. На рис. 4.4А. приведена характерная гель-электрофореграмма СР2. Нижняя мажорная полоса чуть выше полосы, соответствующей 20 кДа маркера, на гель-электрофор еграмме соответствует мономеру (26 102 Да), вторая полоса чуть ниже полосы маркера в 50 кДа - димеру СР2 (52 205 Да), что также подтверждается иммуноблоттингом (рис 4.4В.). Димеры образуются только во время очистки, т.к. первоначальный анализ экспресии и его растворимости выявил наличие одних мономеров белка (рис. 4.2.). В последовательности СР2 содержится только один цистеин, Cys25. По данным компьютерного выравнивания последовательностей 4-х родопсинов из H.salinarum (рис. 1.4, [17]) он расположен в первой трансмембранной спирали, в участке, прилегающем к цитоплазматической Рис. 4.4. Гель-электрофореграмма петле. Возможно, солюбилизация СР2 очищенного СР2: А - электрфореграмма молекулами детергента оголяет этот 12_0/о геля? окрашенная кумасси. в _ участок, провоцируя образование результат иммуноблоттинга против цистина. коньюгата Anty-polyHistidin. 1 - белковый маркер (BenchMark) 2 - Когда белковый раствор подвергается воздействию сильного электрического поля, образуется взвесь высокозаряженных микрокапель, в которых после испарения раствора молекулы белка захватывают один, два или более протона из раствора и образуют, соответственно, одно-, двух- или многозарядные ионы.
Они разделяются в электромагнитной квадрополь-массаналитической системе в соответствие с отношением масса/заряд. Результирующий масс-спектр представляет собой набор пиков от протонированных молекул белка. После компьютерной обработки эти данные позволяют определить молекулярную массу белка с ошибкой около 0.01%. Присутствие соли или гидрофобных соединений (например, липидов или детергента), снижает отношение сигнал/шум, и, следовательно, ухудшает качество масс-спектра. Образование побочных продуктов, связывающих ионы натрия, снижает точность определения молекулярной массы белка. Поэтому для приготовлении образцов СР2 для ESI масс-спектрометрии раствор белка сперва диализовали для удаления соли, затем промывали несколько раз ацетоном и гексаном для устранения детергента [84]. Наиболее оптимальной смесью для растворения полученного осадка оказалась смесь хлороформа : метанола : воды : муравьиной кислоты (100:100:35:2, об/об/об/об). Для изучения влияния Р-МЭ на димерообразование СР2 анализировали 2 образца - СР2 без и с добавлением fi-МЭ. Для разрыва возможных S-S-связей к белку после диализа добавляли Р-МЭ до концентрации 20 мМ, и дополнительно инкубировали образец около 20 мин. Исходные масс-спектры СР2 при двух условиях представлены на рис 4.5. На спектрах отчетливо видны многочисленные пики, соответствующих многозаряженным ионам белка. Максимальный теоритически возможный уровень протонирования - 32 протона на мономер белка, что было рассчитано исходя из возможного количества сайтов связывания протонов. В присутствии р-МЭ большинство мономеров СР2 связывали 17 протонов, а в его отсутствие— 18 протонов (рис. 4.5.).
Эти данные были обработаны, и на их основании была рассчитана молекулярная масса белка. Как видно из рис. 4.6., в обоих случаях на спектрах присутствует два основных пика: пик 26 053 ± 2 Да может быть соответствует молекулярной массе модифицированного (+80 Да) СР2 с отщепленным Ml (25 971.4 Да); второй пик (52 106 ± 4Да) соответствует массе димера основного продукта. Добавление Р-МЭ уменьшало интенсивность второго пика, из чего можно заключить, что образование по меньшей мере части димеров вызвано окислением цистеинов.
