Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время общепринято ,что свободнорадикальное окисление липидов биологических мембран является одним из важных компонентов метаболизма клетки, а нарушение регуляции этого процесса можно считать одним из наиболее универсальных механизмов патогенеза на молекулярном я клеточном уровне (Vladlmlrov Уи.А..198б; Halliwell В. et al.,1989). Во многих работах было показано, что в развитии ПОЛ ведущая роль принадлежит ионам металлов переменной валентности, з особенности ионам железа (Владимиров Ю.А. и др., 1972; Dunford н., 1987). Изучению механизма Ре2+-индуцированного ПОЛ посвящено большое число исследований. Однако до сих пор не существует единого представления о механизме реакций с участием ионов железа. Понимание роли Fe2+ в процессах инициирования ПОЛ и места протекания этих реакций, несомненно, должно стимулировать развитие новых подходов к профилактике, диагностике и терапии свободнорадикалышх патологий.
Решение этих задач во многом зависит от развития методов контроля за скоростью процессов ПОЛ в биологических системах. Одним из наиболее перспективных методов исследования ПОЛ является измерение ХЛ, сопровождающей реакции цепного окисления органических соединений. По сравнению с традиционными биохимическими методами этот метод обладает рядом преимуществ: гораздо более высокой чувствительностью, безинерционностью, что позволяет изучать кинетику Оыстропротекающих реакций в реальном масштабе времени, П8 требует деструкции объекта и не вносит возмущения в изучаемые процессы. Однако в настоящее время метод ХЛ недостаточно широко применяется в медико-биологических исследованиях, поскольку его нельзя отнести к прямым, количественным методам изучения ПОЛ. Это связано с тем, что механизм ХЛ в биологических и даже модельных системах до сих пор не вполне ясен. Более точное представление о связи ХЛ с процессами ПОЛ может значительно расширить возможности использования этого метода в научных исследованиях и клинической практике.
Цель и задачи исследования. Целью работы было детальное хемилюминесцеитное исследование кинетики и регуляции процесса Ре2+-индуцированного ПОЛ в наиболее простой мембранной системе -суспензии липосом; изучение механизма ХЛ, сопровождающий Ре2+-индуцированнов ПОЛ, в частности, вклада различных свободно-радикальных реакций в изучаемую ХЛ и возможности их селективного
количественного анализа, с целью повышения информативности ХЛ метода.
Задачи исследования:
I.Изучение кинетики Ре2+-индуцированного ПОЛ и сопровождающей его ХЛ в модельной мембранной системе - суспензии липосом, в отсутствие и в присутствии различных соединений, влияющих на состояние катализатора реакции - ионов Ре2+, с целью выяснения роли различных реакций с участием железа в развитии ПОЛ.
2.Изучение механизма хемилюминесцентных реакций, сопровождающих процесс Рв2+-индуцированного ПОЛ, с целью повышения информативности хемилюмияесцентного метода исследования кинетики свободнорадикальных процессов в мембранных системах.
3.Поиск селективных сенсибилизаторов ХЛ, пригодных для исследования кинетики ПОЛ в мембранах и других биологических системах.
Научная новизна. Показано, что эффективность перекисного" окисления липидов зависит от величины критической концентрации ионов железа в липидной фазе, которая в свою очередь определяется концентрацией свободных ферроионов в водной фазе и способностью мембран и других лшшдных систем связывать ионы железа. Предложен хемшшминесцентный метод определения величины критической концентрации ионов железа. ,
Впервые показано, что кинетика хемилюминесценции, сопровождающей процесс Ре2+-индуцированного перекисного окисления лшшдов в мембранах, является суперпозицией двух хемилюминесцентных реакций, из которых только одна непосредственно связана с реакциями липидных радикалов и отражает скорость процесса свободнорадикального окисления липидов. Предложен спектральный критерий для выделения хемилхшшесценцш, отражающей процессы перекисного окисления липидов в различных системах. Показано, что развитие ХЛ при Ре2+-индуцированном ПОЛ в фосфатном буфере в основном определяется реакциями активных форм кислорода.
Показано, что антиокислительная активность препаратов плазмы крови, измеренная при Ре2+-индуцированном перекисном окислении липидов в модельных мембранных системах, обусловлена способностью различных компонентов плазмы крови главным образом, белков о взаимодействовать с ионами железа. Предложена ХЛ система для скрининга и определения механизма АО действия различных препаратов.
Проведен скрининг сенсибилизаторов хемилюминесценции среда
лазерных красителей кумаринового ряда. Выявлены соединения, способные к селективному усилению хемилюминесценции за счет реакций свободнорадикального окисления липидов более чем на три порядка величины и не оказывающие влияния на изучаемые реакции.
Показано, что лазерные красители кумаринового ряда могут быть использованы для хемилюминесцентного анализа переписного окислеїшя липидов и антиокислительной активности в мембранных системах и лигопротеинах плазмы крови человека.
Практическая значимость работы. Для практического применения наибольшее значение в настоящее время имеет определение уровня перекисных продуктов и антиокислительной активности плазмы крови и суспензий биомембран с целью скрининга групп риска развития заболеваний, дифференциальной диагностики, контроля за динамикой заболевания и эффективностью лечения, а также поиска новых эффективных препаратов антиоксидантного действия. Результаты и выводы работы могут быть использованы в практике научных исследований, в частности, при изучении свободно-радикальных процессов в биологических мембранах и лшопротеидах методом хемилюминесценции с использованием селективных сенсибилизаторов хемилюминесцентных реакций; з клинико-диагностичесісих исследованиях для повышения чувствительности и информативности хемилюминесцентного анализа крови и других препаратов. Полученные данные являются базисными для дальнейших исследований в области свободно-радикальной патологии мембран и физико-химической медицины.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 печатные работы.
Апробация работы. Результаты исследования были доложены на 3 Всесоюзном Совещании по хемилюминесценции, г.Рига, май 1990 г., на Международной школе по кислородным радикалам, г.Ленинград, сентябрь 1991 г., на 4 Международном симпозиуме по количественной спектрометрии в биомедицинских исследованиях, Гент, Бельгия, май 1991 г., и на семинарах, отдела биомедицинской электроники ИРЭ АН СССР, кафедры биофизики 2-го ЫОЛГМИ им.Н.И.Пирогова и отдела биофизики НИИ физико-химической медицины МЗ РСФСР.
Структура диссертации, диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, части посвященной результатам исследований и их обсуждению, выводов и библиографического указателя, включающего 233 источника, из них 158 иностранных. В диссертации содержится 41 рисунок и 9 таблиц.
?