Введение к работе
Актуальность работы Масс-спектрометрия (МС) начинает широко применяться в биологических и медицинских исследованиях после открытия новых методов ионизации ионизация электрораспылением (ИЭР) и MALDI (Matrix Assisted Laser Desorbtion-Ionization), отмеченных в 2002 году Нобелевской премией Исходно метод масс-спектрометрии позволял исследовать состав неизвестных смесей и структуру отдельных молекул методами тандемной масс-спектрометрии, позволяющими проводить диссоциацию отдельных ионов и исследовать масс-спектр ионов-фрагментов Проведение количественного анализа было затруднено тем, что при переведении молекул в газовую фазу с последующим новообразованием происходила фрагментация молекул Однако новые «мягкие» методы ионизации - химическая ионизация при атмосферном давлении, электрораспыление и MALDI - позволяют ионизовать молекулы без их разрушения, чем и обусловлено широкое применение этих методов в биологических исследованиях
После появления «мягких» методов ионизации, начинаются исследования в области количественного анализа при помощи масс-спектрометрии Этот анализ можно осуществить двумя способами при использовании масс-спектрометра в качестве детектора при проведении хроматографического анализа, и при прямом вводе исследуемого раствора В литературе значительно чаще встречается описание первого подхода, поскольку прямой ввод смеси может «перегружать» масс-спектрометр и вызьтать взаимное подавление сигнала от различных веществ Однако метод прямого ввода позволяет значительно ускорить анализ по сравнению с хромато-масс-спектрометрическими методами Вследствие этого значительный интерес представляет сравнение эгах двух методов с целью выбора одного из них для решения задач различного класса
В последнее время значительный интерес обращен к количественному анализу липидов и их производных Интерес к липидам в настоящее время можно сравнить с интересом к геному, который начался в прошлом веке после фундаментального открытия структуры ДНК в виде двойной спирали Уотсоном и Криком Интерес к липидам и количество научных статей, посвященных им, неуклонно возрастает в связи с возможностью использования масс-спектрометрии в этой области, особенно после сопряжения масс-спектрометра с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ/МС) Существует консорциум LIPID MAPS, объединяющий десятки лабораторий во всем мире, занятых исследованиями метаболизма липидов После появления геномики, протеомики и метаболомики говорят уже о выделении из последней такой области науки как липидомика В значительной мере интерес к липидам обусловлен их ролью в развитии различных заболеваний, включая нейродегенеративные и сердечно-сосудистые
Преимуществом метода масс-спектрометрии является возможность детектирования не только суммарного количества липидов различных классов, но и отдельных молекулярных видов различных липидов Это позволяет получать значительно больше информации о изменениях липидного метаболизма при различных патологиях, а также при действии лекарственных препаратов Такие данные можно использовать для мониторинга эффективности лечения, а также для разработки новых стратегий использования существующих и для поиска более эффективных лекарственных препаратов
Целью настоящей работы являлось исследование возможности использования масс-спектрометрии для количественного анализа различных липидов как при прямом вводе, так и при хроматографическом разделении, изучение возможности применения метода хромато-масс-спектрометрии для мониторинга эффективности лечения нейродегенерации альцгеймеровского типа
В связи с этим были сформулированы следующие задачи
-
Показать возможность проведения количественного анализа веществ липидной природы методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением с использованием прямого ввода
-
Исследовать влияние структуры молекул, состава растворителей и присутствия в растворе акцептора протонов триэтшгамина на интенсивность сигнала от простагландинов и полиненасыщенных жирных кислот
-
Исследовать влияние белка БСА на кинетику деградации простагландина Ег
-
Исследовать изменения в спектре молекулярных видов холинсодержащих фосфолшшдов в плазме крови пациентов с БА при лечении ривастигмином -ингибитором холинэстеразы и мемантином (акатинолом) - ингибитором глутаматных рецепторов
-
Исследовать влияние провоспалительного цитокина фактора некроза опухоли альфа (ФНО-а), участвующего в развитии нейродегенеративных заболеваний, на изменение фосфолипидного спектра в структурах мозга мышей (пшпокамп, мозжечок, кора)
-
Определить способность нейропротектора димебона к коррекции нарушений в фосфолипидном спектре мозга мышей, вызванных провоспалительным цитокином ФНО-а
Основные положения, выносимые на защиту
1. Метод МС/ИЭР с прямым вводом позволяет проводить количественный анализ веществ липидной природы при использовании в качестве стандарта соединения, близкого к исследуемым по химической природе
-
Разработаны условия, позволяющие анализировать одновременно содержание в пробе простагландинов и полиненасыщенных жирных кислот методом МС/ИЭР с прямым вводом,
-
Нейропротекторы ривастигмин - ингибитор холинэстеразы и мемантин - ингибитор глутаматэргической системы вызывают сходные изменения в фосфолипидном составе плазмы крови при лечении пациентов с НА, при этом показана избирательность действия этих препаратов на отдельные молекулярные виды исследованных фосфолшшдов
-
Нейропротектор димебон - ингибитор глутаматэргической системы препятствует изменениям в составе липидов различных отделов головного мозга мышей (гиппокамп, кора, мозжечок), вызванным внутрибрюшинным введением ФНО-а
Диссертационная работа выполнена в Институте биохимической физики им НМ Эмануэля РАН
Научно-практическая значимость. Результаты проведенных исследований имеют важное теоретическое и практическое значение для количественного анализа веществ липидной природы методами масс-спектрометрии Полученные данные о селективном действии нейропротекторных препаратов ривастигмина и мемантина на фосфолипидный спектр плазмы крови позволяют говорить о новом механизме действия этих препаратов на молекулярном уровне Данные о том, что ФНО-а является новой биологической мишенью для нейропротектора димебона, позволяют предлагать новые стратегии лечения различных нейродегенеративных заболеваний, в развитии которых принимает участие ФНО-а
Вклад автора. Личный вклад диссертанта состоял в планировании и проведении экспериментов, обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы Лечение пациентов с БА различными лекарственными препаратами проходило в Научном центре психического здоровья РАМН под руководством проф С И Гавриловой
Апробация диссертации и публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 11 печатных работах, из которых 4 - статьи в отечественных научных журналах (входящих в список ВАК) и 7 тезисов докладов
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 139 страницах, включая 49 рисунков, 6 таблиц и список литературы Диссертация состоит из введения, списка аббревиатур, описания объектов, материалов и методов исследования, глав «Обзор литературы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», выводов и библиографического указателя (всего 163 источника, из них 157 опубликованы в зарубежных изданиях)
Сокращения ИЭР - ионизация электрораспылением, МС/ИЭР - масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением, ЖХ/МС - жидкостная хроматография, сопряженная с масс-спектрометрией, ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты, ФНО-а - фактор некроза опухоли альфа, БА - болезнь Альцгеймера, БСА - бычий сывороточный альбумин, PBS - фосфатно-солевой буфер, ГЭБ - гематоэнцефалический барьер, PGE2 - простагландин Ег, АА - арахидоновая кислота, DHA - докозогексаеновая кислота, ЕРА - эйкозопентаеновая кислота, АгА - арахидовая кислота, ФХ - фосфатидилхолины, ФЭА -фосфатидилэтаноламшш, ЛФХ - лизофосфатидилхолины, СМ - сфингомиелины, ГлЦер -гликозилированные церамиды
