Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Исследование кинетики образования разности потенциалов на мембранах фотосинтезирующих организмов Карагулян Акоп Карленович

Исследование кинетики образования разности потенциалов на мембранах фотосинтезирующих организмов
<
Исследование кинетики образования разности потенциалов на мембранах фотосинтезирующих организмов Исследование кинетики образования разности потенциалов на мембранах фотосинтезирующих организмов Исследование кинетики образования разности потенциалов на мембранах фотосинтезирующих организмов Исследование кинетики образования разности потенциалов на мембранах фотосинтезирующих организмов Исследование кинетики образования разности потенциалов на мембранах фотосинтезирующих организмов Исследование кинетики образования разности потенциалов на мембранах фотосинтезирующих организмов Исследование кинетики образования разности потенциалов на мембранах фотосинтезирующих организмов
>

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Карагулян Акоп Карленович. Исследование кинетики образования разности потенциалов на мембранах фотосинтезирующих организмов : ил РГБ ОД 61:85-3/320

Содержание к диссертации

Введение

Глава I. Обзор литературы 9

I.I. Бактериальный фотосинтез 9

I.I.I. Общая схема бактериального фотосинтеза 9

I.1.2.Реакционные центры фотосинтезирующих бактерий 12

I.1.3.Первичный акцептор электрона при бактериаль ном фотосинтезе 14

1.1.4.Цитохромы: их функции в бактериальном фотосинтезе 17

1.2.Фотосинтез у высших растений 24

I.2.1.Общая схема фотосинтеза у высших растений.. 24

1.2.2. Строение и функции фотосистемы I 26

1.2.3. Строение и функции фотосистемы 2 28

1.2.4. Локализация фотосинтетического аппарата в клетке 29

1.3. Методы измерения мембранного потенциала на мембранах фотосинтезирующих объектов . 33

1.3.1. Объекты исследований 34

1.3.2. Спектральные методы измерений 36

1.3.3. Потенциометрические методы измерений 41

Глава 2. Материалы и методы исследований 45

2.1. Выделение хроматофоров 45

2.2. Выделение и встраивание реакционных центров-из RJaodopseudomonas spJaaeroidas в мембрану протеолипосом 45.

2.3. Выделение субхлоропластных фрагментов 46

2 2. Ассоциация белково-липидных везикул с искусственной фосфолипидной мембраной 47

2.5. Измерение быстрой кинетики генерации в системе "белково-липидные везикулы - искусственная фосфолипидная мембрана" 48

2.6. Регистрация кинетики светозависимых спектральных изменений в препаратах хроматофоров 49

2.7. Окислительно-восстановительное титрование 52

2.8. Измерение концентрации фенадинметосульфата 52

2.9. Источники света 52

2.10.Реактиви 57

Глава 3. Результаты и обсуждение 58

3.1. Исследование быстрой кинетики генерации мембранного потенциала реакционными центрами фотосинте-зирующей бактерии Rps. spaeroides 58

3.2. Исследование быстрой кинетики образования разности потенциалов фотосинтезирующими бактериями Chr. minutissimum u Ect. shaposiinikovii.

3. 2.1. Исследование кинетики нарастания и спада хроматофоров 72

3.2.2. Окислительно-восстановительное титрование , возникающей на мембранах хроматофоров 75

3.2.3. Сопоставление кинетических и потенциометричес-ких характеристик генерации Д^с характеристиками электротранспортных процессов у бактерий Слг. minutissimum u Ect. snaposianikovii. 80

3.3.1. Исследование фотоэлектрической активности легкой фракции субхяоропластных фрагментов... 93

3.3.2. Исследование фотоэлектрической активности тяжелой фракции субхлороплаотных фрагментов.. 103

ВЫВОДЫ 109

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ III

Введение к работе

Актуальность проблемы. Согласно хемиосмотической гипотезе Митчелла (ІЗІД32І , в последнее время получившей всеобщее признание и многочисленные экспериментальные подтверждения, генерация трансмембранной разности электрических потенциалов(Д"цг)является важнейшим этапом в процессе преобразования химической и световой энергии в универсальный энергетический эквивалент клетки - молекулу АЇФ.

Кроме того, электрическая энергия в виде аг-р на сопрягающих мембранах может непосредственно использоваться для совершения осмотической,механической и др.видов работ в клетке.

Велика роль мембранного потенциала также в регуляции биохимических процессов, протекающих в мембранах.

В связи с этим, большой интерес представляет изучение закономерностей генерации д"ьк , природы этих процессов, их кинетических и термодинамических характеристик.

В последнее время, с появлением соответствующих технических возможностей у нас в стране и за рубежом особенно интенсивно ведется исследование быстрых стадий образования разности электрических потенциалов на мембранах фотосинтезирующих объектов. Однако методы, применяемые для определения трансмембранной Д^К являются по большей части косвенными, (регистрация каротиноидного сдвига, использование красителей - индикаторовДЦ* идрН }, и, зачастую, интерпретация получаемых ответов вызывает определенные трудности.

Используемая нами методика прямого измерения Д'Ф в сочетании со спектральными методами позволяет идентифицировать отдельные переносчики электрона, вносящие вклад в процесс генерации ЛН-*" при фотосинтетическом транспорте электронов и определить кинетические и термодинамические параметры этих процессов, что представляет несомненный научный интерес.

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования явилось систематическое изучение быстрых стадий генерации Л"^ на мембранах фотосинтезирующих объектов как растительного, так и бактериального происхождения, а также исследование электрогенной активности изолированных светопреобразующих пигментбелковых комплексов в модельной системе.

Были поставлены следующие задачи: І) в связи с тем, что регистрация Аїр на мембранах высших растений не проводилась прямым методом с высоким временным разрешением, была сделана попытка выбрать подходящий для этой цели объект, подобрать условия для измерения Д^и исследовать особенности быстрых стадий генерации на мембранах высших растений; 2) исследовать влияние ингибиторов электронного транспорта на процесс генерации Лif, а также выяснить роль двух фотосистем в этом процессе; 3) на объектах бактериального происхождения - хроматофорах фотосинтезирующих объектов Ectotiornodospira snaposimikovii И Ciiromatium. minutissimum, -исследовать влияние редокс-медиаторов на кинетику генерируемой д-ф- , определить среднеточечные потенциалы.отдельных переносчиков электрона путем потенциометрического титрования амплитуды фотоэлектрических ответов и выяснить роль низкопотенциальных и высокопотенциальных цитохромов в процессе генерации A\[f ; 4) изучить работу изолированного реакционного центра в модельной системе и показать, что первичный процесс генерациийЦЇ происходит именно в реакционном центре.

Научная новизна работы. В результате проведенных нами экспе- риментов впервые удалось зарегистрировать прямым методом и с высоким временным разрешением генерацию трансмембранного электрического потенциала на субхлоропластных фрагментах высших растений и исследовать влияние окислительно-восстановительных условий и ингибиторов электронного транспорта на этот процесс.

Проведенное на хроматофорах фотосинтезирующих бактерий исследование роли цитохромов в процессе генерации Д Y позволило предложить модель расположения переносчиков электронтранспорт-ной цепи бактерий и уточнить расстояние между ними и локализацию переносчиков в мембране.

В модельной системе впервые прямым методом продемонстрирована фотоэлектрическая активность изолированного реакционного центра, выделенного из фотосинтезирующих бактерий. Rnodopseu-domonas spnaeroides Изучено влияние редокс-медиаторов и ингибиторов электронного транспорта в модельной системе на процесс первичного разделения зарядов в реакционном центре.

Совокупность полученных данных позволила сделать вывод об общности механизмов первичной генерации UXjS в фотосинтезе высших растений и бактерий.

Практическое значение работы. Результаты исследований генерации трансмембранного потенциала на мембранах фотосинтезирующих объектов углубляют существующие представления о молекулярных механизмах, происходящих при фотосинтезе процессов.

Перспективность применения принципов аккумулирования солнечной энергии живыми организмами делает подобные исследования необходимым этапом в создании искусственных систем, способных к высокоэффективному использованию солнечной энергии для практических нужд.

Общая схема бактериального фотосинтеза

В последние годы ведется интенсивное изучение механизмов бактериального фотосинтеза. Эти исследования позволяют понять сущность процессов фотосинтеза у высших растений, хотя различия в строении фотосинтетического аппарата бактерий и высших растений велики. При освещении зеленых растений происходит выделение кислорода, в отличие от бактерий, у которых кислород либо препятствует росту, либо угнетает синтез бактериального хлорофилла. Другая существенная особенность бактериального фотосинтеза - наличие только одной световой реакции.

Экзогенными донорами электронов при бактериальном фотосинтезе служат восстановленные органические субстраты. У серных фотосинтезирующих бактерийCnlorobiaceae и Cnromatiaceae -это сероводород и тиосульфат, а у несерных бактерий Riiodospi-rillaceae - яблочная и янтарная кислоты. Кроме того, фотосинтезирующие бактерии различаются по природе пигментов, входящих в состав светособирающей антенны, передающей возбуждение на реакционный центр. Ciiromatiaceae и Rhodospirillaceae -так называемые пурпурные фотосинтезирующие бактерии - содержат в светособирающей антенне бактериохлорофиллы айв, в то время как Cnlorobiaceae - зеленые фотосинтезирующие бактерии - особый вид хлорофилла, называемый хлоробиум-хлорофиллом, более близкий по своим спектральным свойствам к хлорофиллу высших растений I4l

Внутриклеточные органеллы, ответственные за процесс фотосинтеза, называются хроматофорами. Они представляют собой впадины внутренней бактериальной мембраны, глубоко вдающиеся в цитоплазму и на определенной стадии роста у некоторых видов бактерий отделяющиеся от мембраны [87]. В процессе выделения из клеток методом ультразвуковой обработки, хроматофоры образуют замкнутые пузырьки, имеющие в диаметре от 300 А у рода Curomatium до 1000 А у рода Rnodospirillum , что примерно в 100 раз меньше тилакоидов высших растений.

Хроматофоры представляют собой, таким образом, самые малые мембранные образования, способные к фотосинтезу. В белково-ли-пидную мембрану хроматофоров "встроены" компоненты электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) бактерий, а также светособирающая антенна. В мембране одного хроматофора содержится примерно 20 ЭТЦ и около 5000 молекул Бхл ГіІ} .

Ассоциация белково-липидных везикул с искусственной фосфолипидной мембраной

В качестве искусственной фосфолипидной мембраны использовали коллодиевую пленку, пропитанную раствором азолектина из соевых бобов в н-декане. Для приготовления коллодиевой пленки 0,03 мл 1% раствора нитроцеллюлозы в изоамилацетате наносили на водную поверхность. Через несколько минут образовавшуюся на поверхности воды пленку коллодия снимали с помощью кольца, вырезанного из сынпорового фильтра с диаметром пор 0,17 мкм. Пленка сохла на воздухе в течение 1-2 часов. Высохшую пленку смачивали раствором азолектина в концентрации 100 мг/мл, помещали на отверстие диаметром 4 мм в разборной тефлоновой кювете и зажимали между двумя отсеками кюветы. После этого в оба отсека добавляли 4 мл среды инкубации и в один из отсеков -суспензию исследуемых белково-липидных везикул.

Ассоциация везикул с искусственной фосфолипидной мембраной достигалась добавлением в каждый отсек 25 мМ МпО или 20 мМ СаСІ и инкубацией в течение 5- 12 часов при постоянном и интенсивном перемешивании магнитными мешалками. Затем производилась замена среды в обоих отсеках с помощью перистальтического насоса.

Исследование быстрой кинетики генерации мембранного потенциала реакционными центрами фотосинте-зирующей бактерии Rps. spaeroides

Светозависимый перенос электронов в мембранах фотосинтези-рующих бактерий приводит к образованию трансмембранной разности электрических потенциалов [60 ] . Как было показано [72 ] , функцию фотоэлектрического генератора в хроматофорах несерных пурпурных бактерий выполняют комплексы реакционных центров Р870. Быстрая кинетика генерации и спада АЦ была исследована на хроматофорах, выделенных из различных видов фотосинтезирую-щих бактерий [8, 22) .В последнее время в ряде лабораторий были сделаны попытки изучить генерацию реакционными центрами в бислойных мембранах [167 ] . Однако фотоэлектрические ответы в такой системе были весьма незначительны по амплитуде и регистрировались только в присутствии доноров и акцепторов электронов, добавляемых по разные стороны бислойной мембраны. Кроме того, в этих работах не содержалось доказательств истинного встраивания реакционных центров в бислой и не было проведено исследования быстрой кинетики процессов образования и спада светозависимой Д1+ Метод прямой регистрации быстрой кинетики генерации Д "4 впервые применен нами для исследования фотоэлектрической активности протеолипосом, содержащих реакционные центры из бактерий Rps. spJaaeroides.

Похожие диссертации на Исследование кинетики образования разности потенциалов на мембранах фотосинтезирующих организмов