Введение к работе
Актуальность темы. Глобальной проблемой белкового фолдинга остается арадокс Левинталя: каким образом из множества конформаций, которые, ізалось бы, может принять аминокислотная последовательность, выбирается цна, присущая нативной молекуле белка? Одним из этапов на пути решения гой проблемы стало обнаружение компактного денатурированного состояния СЦС) белка - промежуточного между нативным состоянием и беспорядочным тубком, которое сохраняет вторичную структуру, но теряет уникальную ространственную, определяемую, главным образом, взаимодействием боковых ;пей аминокислотных остатков.
Детальный анализ структуры КДС экспериментальными методами алкивается с определенными трудностями: кристаллизация' невозможна из-за >льшой подвижности составных' частей белковой молекулы, использование іектроскопических методов усложнено тем, что белок находится в компактном сатурированном состоянии непродолжительное время и этих состояний, как завило, несколько. Более того, результаты исследований КДС, проведенных ізньїми спектроскопическими методами, противоречат друг другу. Например, інньїе кругового дихроизма свидетельствуют о сохранении вторичной структуры :больших белков в КДС, а данные метода одномерного *Н ЯМР высокого ізрешения - о практически полном ее изчезновении. Таким образом, для іработки единых критериев оценки структуры КДС отсутствуют точные шичественные методы изучения. В этой связи интересным представляется ;тод имитации молекулярной динамики (МД). МД сочетает в себе детальную (формацию о молекулярной структуре с необходимым временным разрешением я проведения анализа последовательности изменений в ходе процесса натурации.
Цель исследования состояла в изучении структуры компактного натурированного состояния методом имитации молекулярной динамики, юме того, необходимо было найти иную интерпретацию данных одномерного I ЯМР высокого разрешения по структуре КДС, которая бы не противоречила иным других методов исследования.
Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии Казанского государственного университета и в Институте микробиологии и молекулярной биологии университета им.Юстуса Либиха (Гиссег, ФРГ).
Научная новизна и практическая значимость работы. Изучение структуры КДС методом имитации молекулярной динамики было проведено на примере биназы (рибонуклеазы из Bacillus intermedius 7Р). Последовательность изменений конформации белковой молекулы при моделировании денатурируюших условий свидетельствовала о том, что в процессе разворачивания биназа проходит через стадию промежуточного состояния. Это промежуточное состояние характеризовалось всеми особенностями компактного денатурированного состояния: компактностью и наличием вторичной структуры, большей, по сравнению с нативной, подвижностью составных частей белковой молекулы, увеличением доступной плошали поверхности, экспонированностью неполярных аминокислотных остатков в раствор и проникновением воды внутрь белка.
Для конформаиий биназы в нативном и.компактном денатурированном состояниях были проведены расчеты величин вторичных химических сдвигов, вызванных кольцевыми токами ароматических аминокислот, для некоторых метальных и метиленовых протонов гидрофобных участков белковой молекулы. Как оказалось, высокоамплитудные внутримолекулярные движения в компактном денатурированном состоянии при условии сохранения равновесной структуры белковой молекулы уменьшают величину химического сдвига. Тем не менее, он не исчезает полностью, как показывают данные метода одномерного 'Н ЯМР высокого разрешения. Для уничтожения больших остаточных химических сдвигов требуются дополнительные факторы.
Одним из таких факторов может быть проникновение молекул воды в гидрофобные участки белка в КДС. Для неподвижных молекул воды в гидрофобной области биназы были проведены расчеты величин вторичных химических сдвигов протонов, вызываемых электрическим полем молекулярного диполя. Полученные значения оказались сравнимы по порядку величины с остаточными химическими сдвигами, которые не удалось усреднить до нулевых значений с помощью высокоамплитудных внутримолекулярных движений, и противоположны им по знаку.
Таким образом, в данной работе:
Впервые проведена имитация молекулярной динамики биназы при ативных и денатурирующих условиях. При этом на примере конкретного белка эказана последовательность конформационных изменений при разворачивании їлковой молекулы и охарактеризована структура компактного сатурированного состояния.
Впервые проведен сравнительный анализ величин химических сдвигов, клученных методом 'Н ЯМР высокого разрешения и рассчитанных при цитации молекулярной динамики для компактного денатурированного стояния. Результаты анализа дают альтернативную интерпретацию данных шомерного 'Н ЯМР по структуре КДС, которая не противоречит данным іугих методов исследования.
Впервые проведено количественное сопоставление данных 'Н ЯМР для лковой молекулы и ее взаимодействия с водой. На основании проведенного поставлення можно сделать вывод, что вода является структурным элементом лковой молекулы в компактном денатурированном состоянии.
Перечисленные результаты в значительной степени расширяют шествующие представления о структуре и свойствах компактного натурированного состояния и о роли воды в процессе белкового фолдинга.
На зашиту выносятся: Результаты изучения характера процесса денатурации белка биназы. Данные, идетельствугошие о формировании компактного денатурированного состояния и разупорядочивании белковой молекулы биназы.
Результаты сравнительного анализа спектральных характеристик белковой лекулы, полученных методом ЯМР высокого разрешения и рассчитанных при итации молекулярной динамики.
Способность электрического поля молекул воды сдвигать сигналы протонов гильных групп в сторону низких полей как одной из возможных причин іезновения вторичных химических сдвигов в КДС.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались итоговых научных конференциях Казанского государственного университета ізань, 1994, 1995), семинаре Института микробиологии и молекулярной )Логии университета им.ЮЛибиха (Гиссен, ФРГ, 1996).
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 9 печатньг. работах, включающих 3 статьи.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на ПО страница машинописного текста, содержит 15 таблиц, 28 рисунков. Работа состоит и введения, шести глав, заключения и списка литературы (97 наименований). .