Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ - 9
1.1. Na/K-АТФаза: молекулярная структура, механизм функционирования и регуляция 9
Основные кинетические характеристики Na/K-АТФазы 9
Состав и изоформы Na/K-АТФазы 10
Структура Na/K-АТФазы, сайты связывания ионовиАТФ 12
1.1.5. Регуляция Na/K-АТФазы 16
Ингибиторы Na/K-АТФазы 17
Эндогенные уабаин-подобные соединения (EOLS) и их роль в патогенезе гипертонической болезни , 20
1.2. ЫА/К.-АТФАЗА КАК УНИВЕРСАЛЬНЫ И РЕГУЛЯТОР ТРАНСМЕМБРАННОГО ГРАДИЕНТА НАТРИЯ И КАЛИЯ 21
Генерация мембранного потенциала. 21
Системы транспорта, сопряженные с переносом Na* и К* 22
Регуляция объема клеток 23
1.3. NA/K-АТФАЗА И ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ 25
Гены, экспрессия которых регулируется активностью Na/K-АТФазы 25
Сигнальные каскады, запускаемые ингибировштем Na/K-АТФазы 26
1.4. РОЛЬ NA/K-АТФАЗЫ В РАЗВИТИИ КЛЕТОЧНОЙ СМЕРТИ 29
Апоптоз и некроз - два вида клеточной смерти 29
Ингибирование Na/K-АТФазы как фактор защиты клеток от апотоза. 34
Уабаин как инициатор клеточной смерти. 37
1.5. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ СЛЕДУЮЩИЕ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ. .42
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46
2.1. Культура клеток .46
Клетки гладких мышц сосудов (VSMC) (vascular smooth muscle cells) 46
Клетки гладких мышц, трансфщированные Е1А аденовирусом (Е1А VSMC) 46
Эпителиальные клетки С7 и CI 1 MDCK 48
Эндотелиальные клетки сосудов (РАЕС) 49
2.2. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК 50
Фазово-контрастная микроскопия , , , 50
Сохранение связи клеток с подложкой 50
Окраска клеток трипановым синим , 51
2.3. БИОХИМИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК 51
2.3.1. Деградация МТТ 51
2.4. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ АПОПТОЗА И НЕКРОЗА 52
Определение клеточного объема... 53
Определение количества фрагментировапиого хроматина 54
Определение содерэ/сания низкомолекулярных фрагментов ДНК, 56
Активность каспазы-3 57
2.5.МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ИОННОГО ГОМЕОСТАЗА КЛЕТОК 58
Определение активности Na*/1С-насоса 58
Определение содержания обмениваемого калия и натрия 55
Определение свободного и обмениваемого внутриклеточного кальция і 59
Измерение внутриклеточногорН. 60
2.6. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕМЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 61
Определение общей и меченой 3Н-тимидином ДИК 61
Определение экспрессии бечков (Western Blot) 61
Определение экспрессии РНК (Northern Blot) 62
Измерение синтеза РНК и белка 63
2.7. РЕАКТИВЫ 63
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ . 64
3.1. ИНГИБИРОВАНИЕ NA/K-АТФАЗЫ УАБАИНОМ ЗАЩИЩАЕТ КЛЕТКИ ГЛАДКИХ МЫШЦ ОТ АПОПТОЗА,
ВЫЗВАННОГО РАДИОАКТИВНЫМ МЕЧЕНИЕМ ДНК 64
Ингибирование клеточного роста Ґ HJ-тимидином протекает через его включение в ДНК. 64
Сравнительный анализ эффекта [ Щ-тимидина нарост VSMC, эпителиальных и эндотелиальных клеток 66
Влияние [3Щ-тимидина на синтез ДНК 67
Обработка клеток IіНJ-тимидином вызывает их смерть 68
3.1.5. Внедрение [' Щ-тимидина в ДИК клеток вызывает их апоптоз 70
3.2. МЕХАНИЗМ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ РАННЕГО ОТВЕТА В VSMC СОСУДОВ, ВЫЗВАННЫЙ ИНГИБИРОВАНИЕМ
NA/K-АТФАЗЫ 74
Ингибирование Na/K-АТФазы вызывает резкое увеличение экспрессии c-Fos 74
Уабаин вызывает экспрессию c-Fos через увеличение соотношения [Na*]/[iC]i 75
Вызванная уабаином экспрессия c-Fos проходит через увеличение [Na*]i 77
Роль клеточного объема, внутриклеточного рИ и Са2* в инициированной уабаином экспрессии с-Fos 78
3.3. ПОИСКИ НАЧАЛЬНОГО СИПІАЛА, ПРИВОДЯЩЕГО К ГИБЕЛИ КЛЕТОК ЭПИТЕЛИЯ ПОЧЕЧНЫХ КАНАЛЬЦЕВ ПРИ
ДЕЙСТВИИ УАБАИНОМ , 82
Маркеры смерти C7-MDCК клеток при действии уабаина 83
Роль Na/K-АТФазы и внутриклеточных концентраций калия и натрия 89
Роль кальция 94
Роль макромояекулярного синтеза в смерти эпителиальных клеток, инициированной уабаином9 5
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 97
ИНГИБИРОВАНИЕ УАБАИНОМ NA/K-АТФАЗЫ В VSMC ПОДАВЛЯЕТ АПОПТОЗ, ВЫЗВАННЫЙ РАДИОАКТИВНЫМ МЕЧЕНИЕМ ДНК 91
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ РАННЕГО ОТВЕТА В VSMC СОСУДОВ, ЗАПУСКАЕМАЯ УАЕАИНОМ; ДОКАЗАТЕЛЬСТВА НОВОГО NA+|-OnOCPEflOBAHHOrO СА2+,-НЕЗАВИСИМОГО МЕХАНИЗМА СОПРЯЖЕНИЯ ВОЗБУЖДЕНИЯ И
транскрипции 99
4.3. Некроз в клетках эпителия почечных канальцев, обработанных уабаином, не связан с
ИНГИБИЮВАНИЕМ ИОННЫХ ПОТОКОВ, опосредованных N а/К-АТФазой 103
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 107
выводы, ш
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115
Введение к работе
В 1997 году Нобелевская премия по химии была присуждена профессору Иенсу Кристиану Скоу за открытие в 1957 году Na/K-АТФазы (Skou JC, 1957), фермента, который поддерживает баланс калия и натрия в клетке.
В своей первой статье профессор Скоу показал, что в мембранной фракции, изолированной из нервных волокон краба Carcinus maenas, содержится аденозин-трифосфатаза, активируемая при совместной добавке натрия и калия. Вскоре было установлено, что этот фермент является универсальным молекулярным механизмом, который использует энергию гидролиза АТФ для поддержания неравновесного распределения этих катионов между клеткой и внеклеточной средой (Skou JC, 1965).
Последующие исследования показали, что Na/K-АТФаза - это интегрированный в клеточную мембрану белок, ответственный за транспорт 3Na+ и 2К+ против их электрохимических градиентов. Электрохимические градиенты моновалентных катионов, создаваемые Na/K-АТФазой, необходимы для поддержания мембранного потенциала, клеточного объема (Lang F et al., 2000; Mongin АА and Orlov SN, 2001) и транспорта других ионов и низкомолекулярных органических соединений за счет систем сопряженного транспорта, как то Na+/H+ и Ыа+/Са24"-обменники, На+,К+,СГ-котранспорт, котранспорт Na+ с аминокислотами, глюкозой, фосфатами и нейротрансмиттерами (Blanco G and Mercer RW, 1998) (см. рис. 1).
Осмолиты
Системы, активируемые при набухании
Системы активируемые при сжатии
Рис. 1. Взаимосвязь между объемом клетки и системами, регулирующих ионный гомеостаз
Учитывая ключевую роль Na/K-АТФазы в регуляции ионного гомеостаза, неудивительно, что ингибирование этого фермента влияет на целый ряд клеточных параметров. Так, сердечные гликозиды (например, дигитоксин, уабаин), одни из наиболее сильных природных ингибиторов Na/K-АТФазы, использовались для лечения сердечной недостаточности, некоторых аритмий и отеков с конца XVIII-ro столетия (Withering W, 1785;Hoffman and Bigger, 1985). Механизм их действия заключается в том, что, ингибируя Na/K-АТФазу, сердечные гликозиды деполяризуют клеточную мембрану и повышают внутриклеточный уровень Na+. Вслед за этим через Na+/Ca +-обменник (Lang F et al., 1998а) и потенциал-активируемые Са2+-каналы (Lang F et al., 1992) повышается концентрация внутриклеточного Са2+, что приводит к усилению сокращений
кардиомиоцитов и увеличивает чувствительность клеток гладких мышц к вазоконстрикторам (Glitseh, 2001;Blaustein and Lederer, 1999). При этом увеличение [Са2*] часто вызывает активацию Са^-зависимых КГ-каналов, которые усиливают вызванный ингибированием Na/K-АТФазы отток калия из клетки и, таким образом, приводят к ее сжатию. В клетках ряда тканей это может инициировать апоптоз. С другой стороны, увеличение концентрации натрия н отрицательно заряженных ос молитов может привести к набуханию клетки и некрозу (рис. 2).
гУабаин
Ж*
Апоптоз или его маркеры
р«рі
Активация NaJC,2C}-котрянсішр 1 в
4а*
Na+J К+Д
Транзиентное сжатие
Са-активируемые К-канавы
Набухание диссипация Ем Na/Ca24 обменник
Некроз
Потентгиал-аггивируемые Са2+ каналы.
Са2+/
Сокращение кардиомиоцитов
Рис 2. Na/K-АТФаза как регулятор ионного гомеостазе и объема клетки
Наряду с этими явленнями в последнее время было обнаружено, что активность Na/K-АТФазы регулирует экспрессию некоторых генов, в том числе генов, контролирующих проведение сигналов, пролиферацию клеток и программируемую клеточную смерть (апоптоз) (Taurin S et aL, 2002а). С использованием в качестве модели сердечных мноцитов было обнаружено, что частичное ннгибирование Na/K-АТФазы стимулировало рост клеток, синтез белка, вызывало активирование некоторых протоонкогенов и факторов транскрипции (McGowan МН et aL, 1999; Xie Z et aL, 1999). Несмотря на то, что вышеперечисленные эффекты уабанна на пролиферацию клеток и экспрессию генов изначально были приписаны изменению концентрации [Са~% (Peng М
et al., 1996c), в данный момент установлено, что хотя увеличение [Са+] и является необходимым, но не достаточным условием для протекания этих процессов. Более того, ряд наблюдений указывает на то, что уабаин может влиять на функционирование клеток в остутствие существенного изменения внутриклеточных концентраций натрия и калия (Xie Z and Cai Т, 2003).
В соответствии со схемой, представленной на рис. 2, первоначальными сигналами, приводящими к формированию клеточного ответа на ингибирование Na/K-АТФазы уабаином, могут быть увеличение [Na+]i или уменьшение [К*] і, изменение клеточного объема (связанное с перераспределением одновалентных ионов), [Na+]j -зависимое увеличение внутриклеточной концентрации свободного кальция и/или закисление цитоплазмы, деполяризация мембраны и изменение активности -чувствительных к электрическому потенциалу (Ем) мембранносвязанных белков. Кроме того, нельзя исключить и тот факт, что достаточным условием для генерации сигнала являются конформационные превращения Na/K-АТФазы при ее взаимодействии с середечными гликозидами, а также наличие рецепторов этих соединений, отличных: от Na/K-АТФазы. Целью нашего исследования являлось изучение вклада вышеперечисленных факторов, инициированных ингибированием- Na/K-АТФазы уабаином, в регуляцию экспрессии генов и смерть клеток. При разработке: стратегии нашего исследования мы исходили из следующих основополагающих данных.
В 1999 году в нашей лаборатории было установлено, что обработка клеток гладкой мускулатуры сосудов (VSMC) уабаином резко замедляет развитие апоптоза, вызванного устранением ростовых факторов (Orlov SN et al., 1999). Известно, что наряду с химическими соединениями, апоптоз может быть вызван, воздействием: физических стимулов, наиболее универсальным из которых является ионизирующая радиация. В связи с этим в первой части исследования мы разработали модель запуска апоптоза при действии радиации на культуру клеток и исследовали влияние на этот процесс уабаина.
При изучении ! механизма антиапоптотического действия уабаина: на VSMC было установлено, что этот ингибитор Na/K-АТФазы резко активирует синтез РНК (Orlov SN et al., 2000b) и что его антиапоптотический эффект устраняется в присутствии ингибиторов РНК и белкового синтеза (Orlov SN et al., 2001). Эти результаты позволили предположить, что защита уабаином VSMC от клеточной смерти опосредована, через экспрессию антиапоптотических генов, которые в свою очередь контролируются генами раннего ответа (early response genes — ERG), Это положение было подтверждено во второй части работы, где нам также удалось установить начальные звенья генерации сигнала, запускаемого ингибиторами Na/K-АТФазы.
В отличие от VSMC, долгосрочное воздействие уабаина приводит к некротическому типу смерти ряда других типов клеток, включая клетки эпителия почечных канальцев. В заключительной части работы мы исследовали механизм этого феномена на примере культуры клеток, полученных из собирательных канальцев почки собаки.
