Содержание к диссертации
СтР»
СПИСОК СОКРАЩЕНИЕ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. ПРЕОБРАЗОВАНИЕ ЭНЕРГИИ В ХЛОРОПЛАСТАХ ....8
-
Характеристика электронного транспорта . . 8
-
Процесс фотосинтетического фосфоршшрования 10
1.2. ГИПОТЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ СОПРЯЖЕННОГО ФОСФОРЙ-
ЛИРОВАНИЯ . . . . . 14
-
Химическая гипотеза 15
-
Конформационная гипотеза 18
-
Хемиосмотическая гипотеза 20
1.3. _ СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ Н+-АТФазы ХЛОРОПЛАСТОВ . . 22
-
СГТ, связанный с мембраной хлоропластов . . 23
-
Выделение СГр структура и субъединичный состав 25
-
Мембранные компоненты Н+-АТФазы .28
-
Каталитические свойства СГТ 31
-
Связывание, диссоциация и обмен нуклеотидов 34
-
Стехиометрия АТФазной и синтетазной реакций сопрягающего фактора 37
1.4. ИСШЩОВАНИЕ БЕЛКОВ С ПОМСЩНЗ ЭТЕНОВЫХ ПРОИЗ
ВОДНЫХ АДФ И АТФ ( АДФ, АТФ) ........ 41
1.4Л. їгАДФ и гАТФ как субстраты ферментативных
реакций 42
1.4.2. Использование єАДФ и е.АТФ в качестве флуо
ресцентных меток для исследования структуры
ферментов 45
Стр.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ . . . 49
ГЛАВА П МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 51
2.1. ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ . . ... ... ... . . 51
-
Выделение хлоропластов 51
-
Выделение и очистка CF, 52
-
Реконструкция ЭДТА-обработанных хлоропластов CF-j- .54
-
Синтез *АДФ и АТФ 55
-
Ковалентное связывание еАДФ с CFj . . . , 57
2.2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ . . . 58
-
Спектральные характеристики *АДФ и еАТФ . . 59
-
Определение АТФазной активности CFj .... 60
-
Определение АТФ и еАТФ в процессе фотосинтетического фосфорилирования 64
ГЛАВА Ш РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 68
3.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛИРОВАННОГО CF-j- 68
-
Субъединичный состав CFj .......... 68
-
Субстратсвязывавдие свойства CF-r . Ковалентное связывание нАДФ с CFj 68
3.1.3, Кинетические характеристики АТФазной
реакции CFj 71
3.1.4, Влияние эпигашюкатехина и эпигаллокатехин-
галлата на АТФазную и АТФсинтетазную реакции
CFj 81
3.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ФОТОФОСФОРШІИРОВАНИЯ С
ПОМОЩИ) еАДФ 88
3.2.1. Фотофосфорилирование єАДФ и АДФ в хлоропластах. Реконструкция ЭДТА-обработанных
_;_; , .. ,....,_ Стр.
хлоропластов CF-r с ковалентно связанным
єАДФ 88
3.2.2. Исследование флуоресценции нАДФ в ЭДТА-обработанных хлоропластах, реконструированных CTj с ковалентно связанным єАДФ . » 92 3.3. ВЫЯСНЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ЭТАПОВ РЕАКЦИЙ ФОТОФОСФО-РИЛИРОВАНЙЯ НА ОСНОВЕ ИССЛЕДОВАНИЙ В МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ ................. 95
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 105
ВЫВОДЫ 109
ЛИТЕРАТУРА III
АДФ, АТФ АДФ, аТФ ІГ^-АТФаза
GFj (Fj)
ддкд
Кверцетин НАДФ+ НЩ-СІ ПХ
Трис-буфер
Трицин
ЭДТА
ЭГКГ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
аденозин-5'-ди-и-трифосфат
]>г-этеноаденозин-5' -ди-и-трифосфат
протонная аденозинтрифосфатаза, состоящая из каталитической части (CFj) и мембранного компонента (CF0), выполняющего функции протонного канала
сопрягающий фактор из хлорогшастов (митохондрий)
мембранная часть І^-АТФазного комплекса хлоро-пластов (митохондрий)
д/Лдициклогексилкарбодиимид
3,3' ,4',5,7-пентаоксифлавонол
никотинамидадениндинуклеотидфосфат
7-хлор-4-нитробензо-2окса-1,3-диазол
пластохинон
пластоцианин
трихлоруксусная кислота
трис (оксиметил)-аминометан
трис (оксиметил)-глицин
ферредоксин
неорганический фосфат
флавопротеид
- V -метилфвназинметосульфат
хлорофилл
этилендиаминтетрауксусная кислота
эпигаллокатехин (3,3',4',5',5,7-гексаокси-флаванол
- эпигаллокатехингаллат
Введение к работе
Существенный прогресс в исследовании механизма синтеза АТФ в важнейших энерготрансформирующих органеллах (хлоропластах, митохондриях) связан с появлением хемиосмотической концепции сопряженного фосфорилирования, предложенной П.Мит-челом. Согласно этой концепции, энергия окислительно-восстановительных реакций в цепи переносчиков электронов запасается в виде электрохимического потенциала Н+( л/ин+), а затем используетсй обратимой Н+-ЖТФазой для синтеза АТФ.
В настоящее время усилия исследователей сосредоточены на выяснении молекулярного механизма трансформации энергии ь/дн+ в энергию фосфоангидридной связи АТФ. Значительные успехи достигнуты в изучении структуры Н-АТФазы, - ключевого ферментативного комплекса системы трансформации энергии. Установлен субъединичный состав Н+-АТФазы: каталитическая часть содержит 5 типов субъединиц, а мембранная, выполняющая функции протонного канала - (3-5). Осуществлен синтез АТФ за счет ajuh+ в искусственных фосфолишщных пузырьках со встроенным Н+-АТФазным комплексом, что является убедительным подтверждением хемиосмотического принципа сопряжения. Однако каталитическая стадия этого процесса (механизм синтеза АТФ в активном центре Н^АТФазы) остается не выясненной и представляет актуальную проблему биоэнергетики.
Интересные результаты, с точки зрения приближения к условиям in vivo , были получены в исследованиях по реконструкции АТФаинтетазной системы в хлоропластах, лишенных оопряга-ющего фактора. В частности, установлена роль отдельных субъ- единиц в функционировании фермента сопряжения.
В данной работе, направленной на изучение механизма фотосинтетического фосфорилирования, наряду с методом реконструкции АТФсинтетазной системы в ЭДТА - обработанных хлоропластах, применяли также метод флуоресцентных меток, позволяющий получать ценную информацию о структурных, функциональных и регуляторных аспектах сопряженного фосфорилирования. В качестве флуоресцентных меток были использованы этеновые производные адениннуклеотидов и физиологически активные вещества фенольной природы (катехины).
На основе полученных экспериментальных данных предложен гипотетический механизм синтеза АТФ в каталитическом центре Н+-АТФазы. -
