Исследование структурно-функциональной организации Са2+ - активируемого фотопротеина обелина из гидроидного полипа Obelia longissima методами генной инженерии Илларионова, Виктория Альбертовна

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Са^:*-активируемые фотопротеины обнаружены в более чем 25 видах биолюминесцесцирующих морских кишечнополостных организмов. Они представляют собой устойчивый комплекс из трех компонентов: апобелка, полициклического хромофора (целентеразина) и молекулярного кислорода. При связывании Са²⁺ EF-подобными Са²⁺-связывающими сайтами фотопротеина запускается реакция окислительного декарбоксилирования целентеразина, в ходе которой генерируется свет в видимой области спектра. Изучение фотопротеинов актуально по нескольким причинам. Во-первых, механизм фотопротеиновой реакции остается еще во многом неясным. Исследования в этой области расширят представления о принципах и возможностях ферментативного катализа. Во-вторых, пока неизвестно каким образом связывание Са²* и индуцированный этим конформационный переход в структуре Са²⁺-связывающих сайтов регулирует активность Са²⁺-активируемых белков. Исследование механизма конформационных изменений в структуре фотопротеинов, вызванных конформационными переходами в Са²⁺-связывающих сайтах, внесет вклад в установление общих принципов структурно-функциональных отношений в Са²⁺-активируемых бглках. В третьих, поскольку фотопротеины находят широкое .применение в качестве индикаторов вігутри клеточного Са²* и люминесцентных меток в иммуноанализе, знание первичной структуры кДНК, кодирующей фотопротеин, и его люминесцентных свойств совершенно необходимо для его практического использования.

ЦЕЛЬЮ диссертационной работы явилось исследование первичной структуры фотопротеина обелина из гидроидного полипа Obelia longissima, его люминесцентных свойств, а также влияния аминокислотных замен в Са²⁺-связывающих сайтах обелина на его люминесцентную функцию.

Были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Определить нуклеотидную последовательность кДНК апообелина из гидроидного полипа Obelia longissima. Определить полную аминокислотную последовательность белка, восстановленную по нуклеотидной последовагельности кДНК апбобелина. Локализовать Са²⁺-связывшощие сайты в первичной структуре апообелина.

2. Разработать метод эффективной экспрессии гена апообелина в E.coli.

3. Изучить биолюминесцентные свойства выделенного из E.coli и
заряженного синтетическим целентеразшюм обелина и оценить возможность

его использования в качестве биологического индикатора внутриклеточного

4. Получить с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза мутантные' варианты апообелина с заменами высококонсервативных аминокислот в Са²⁺-связывающих сайтах. Изучить влияние этих замен на люмішесцентаую функцию мутантных вариантов обелина и выявить функционально-важные позиции в структуре Са²⁺-связывающих сайтов.

На защиту выносятся следующие ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ.

Нуклеотидная последовательность кДНК апообелина - апофотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima состоит из 585 нуклеотидов. Полная аминокислотная последовательность аг.ссбелнна, восстановленная по нуклеотидной последовательности кДНК, состоит из 195 аминокислотных остатков и содержит три участка, формирующие Са²⁺-связывающие сайты.

кДНК апообелина эффективно экспрессируется в рекомбинантном штамме E.coli с использованием Т7 РНК-полимеразы. Содержание синтезированного в E.coli апобелка составляет 5 мг на 1 грамм сырой клеточной биомассы.

Заряженный синтетическим целентеразином обелин обладает самой быстрой кинетикой люминесценции среди изученных на сегодня фотопротеинов. Ионы магния в физиологических концентрациях не снижают его чувствительность к Са²⁺. Эти свойства определяют преимущество обелина как биологического индикатора внутриклеточного Са²⁺ по сравнению с другими фотопротеинами.

6 мутантов обелина с аминокислотными заменами по высококонсервативным 6-й и 11,12-й позициям трех Са²⁺-связывающих сайтов сохраняют способность к люминесценции. Замена глицина на аргинин в 6-й позиции незначительно влияет на люминесцентные свойства белка, замена в 11,12-й позициях аспарагиновой и глутаминовой кислот на аланин и глицин, соответственно, приводит к существенным изменениям кинетических параметров люминесценции и диапазона чувствительности к Са²⁺.

Впервые определена нуклеотидная последовательность кДНК апообелина - апофотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima и восстановлена полная аминокислотная последовательность этого белка. На основе данных о первичной структуре апообелина возможно выявление наиболее консервативных аминокислотных остатков и исследование их функции, изучение структуры активного центра белка с помощью

направленных аминокислотных замен, изучение третичной структуры апообелина методами пространственного моделирования.

Впервые достигнута эффективная продукция апообелина в E.coli, исследованы его люминесцентные свойства после реактивации синтетическим целентеразином.

Впервые генерированы направленные аминокислотные замены в Са²⁺-связывающнх сайтах обелина и изучено их влияние на люминесцентные свойства фотопротеина. Эти данные представляют большой интерес для дальнейшего изучения структурно-функционатьной организации Са²⁺-связывающих сайтов всех Са²*-активируемых белков, входящих в EF-семейство.

Определение параметров люминесценции синтезированного в E.coli и заряженного синтетическим целентеразином обелина показало перспективность его использования для мониторинга Внутриклеточного кальция. Особенно полезным обелин может оказаться при исследовании процессов, которые регулируются быстрыми изменениями концентраций Са²*, поскольку среди изученных на сегодня фотопротеинов он обладает самой быстрой кинетикой люминесценции.

На основе данных о первичной структуре апообедина возможно создание методами генной инженерии или химической модификации новых иммунологических зондов, содержащих обелин в качестве биолюминесцентной метки. Определение нуклеотидной последовательности кДНК апообелина позволяет использовать ее также при создании систем мониторинга транскрипции и трансляции in vivo и in vitro.

Результаты проведенного исследования представлялись на VII-m Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценцип, Банфф, Канада 1993; Международном симпозиуме по биолюминесценции, Каанапали-бич, Гаваи, США, 1993; VIII-M Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции, Кембридж, Англия, 1994; 1Х-м Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценцип, Вудс Хоул, США, 1996.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 131 странице машинописного текста, содержит 23 рисунка и 8 таблиц.