Введение к работе
Постановка проблемы, ее актуальность. Одной из актуальних проблем современной молекулярной биофизики является выяснение роли конформациошшх изменений макромолекули в осуществлении ферментон каталитической функции. Остаются нерешенными некоторые вопросы, связанные со способностью белковых глобул изменять пространственную структуру на различных зтпах каталитического цикла.
Диссертация посвяг:."" л изучению механизмов функционирования фосфоглицераткиназы 1ФГК' - одного из ферментов, обеспечивающих трансформацию энергии в клетках. ФГК занимает ключевое место в цепи леакций гликолиза, так как осуществляет перенос -макрозргической связи на конечном этапе синтеза молекуи АТФ. Час. экспериментов выполнена с другим ферментом гликолиза -глицеральдегидфосфатдегидрогеїіазсй (ГАФДГ). Изучение конфор-мрционных изменений этих ферментов, п также эффектов взаимодействия различных вечк.-сп* (субстратов, активаторов, кофакторов и др.) с макромолекулой белкз важны для понимания собственно механизмов функционирог '.ния фосфоккназ и могут служить обоснованием имеющихся представлений о роли конформациошшх перестроек в ферментативном катализе.
Цель и задачи работы. Цель .настоящей раооты состояла в v. следовании влияния субстратов и других веществ на структурны? и функциональные свойства макромолекулы ФГК из дроэден, а т.ікжр и ГАФДГ v мн!'"г свиньи с помокью радиоспектроскопических методов: электронного парамагнитного резонанса и ядерної' магнитной релаксации протонов воды. В задачу работы входило так я:е развитие методов количественной характеристики конформациошшх изменений ферментов. Выбор фермента ФГК обусловлен особенностями строения белковой глобулы, ее способностью изменять кскформацпп, высокой стабильностью и наличием в аминокислотной поог'довательности белка
единственной аминокислоты цистеина, что позволяет присоединить к
белку парамагнитный радикал в точно фиксированном месте.
Научная новизна работы. Впервые показано, что участвующие е
фоефоглицераткиназной реакции ионы М.ч прочк е связкзак-тся с
фермент-субстратным комплексом ФГК - 3-фосфоглицериновая кислота
'3-ФГ), чем с апоформой фермента. Установлено, что дополнительный
центр связывания АТФ на молекуле ФГК локализован в месте
связывания 3-ФГ в активном центре белка. Зарег"стрирована кинетика
связывания ртутьсодержащих меток с SH-группой. Исследование
конформационных изменений белка в области цистеина-97 „ помощью
спиновых меток показало, что различные вещества вызывают
неодинаковые изменения конформации глобулы. При этом было
установлено, что специфический эффект - закрытие "щели" активного
центра - вызывает лишь связывание с ферментом специфического
субстрата 3-фосфоглицерата (3-ФГ). Разработан ме од, позволяющий
о определять расстояния до 60А между парамагнитными частицами с
близкими значениями g-фактоь^в путем регистрации кривых насы^ния
сигналов ЭПР в ограниченном интервале микроволновой мощности.
Получены количественные характеристики влияния субстратов и ряд;
других веществ на прочно свягчнную с белком воду. Методи
протонной магнитной релаксации води зарегистрированы существенны'
конформационные '"шенения белков в ферментативном катализе.
Практическое значение работы. Полученные результаты служа1
экспериментальным подтверждением роли конформационных перестрое
белковой глобулы в ферментативном катализе и.углубляют понимани
механизм осуществления фосфотрансферазной реакции. Результ; г
будут учтены при планировании эка. риментов с другими ферментами
Подобранные условия оптимальной модификации остатка цистеина могу
использоваться при выборе оптимальных условий иммобилизаци
фермента с целью использования его в аналитических и npoqt
устройствах. Детальное исследование особенностей работы с ртутьсодержаїднми метками позволяет рекомендовать эти химические соединения для широкого использования в ЭПР-исследованиях белков. Развитие мете, .а измерения расстояний в макромолекулах по параметрам кривых насыщения спин-меток позволяет оценивать расстояния
о до 60Л. Развит метод регистрации конформационных изменений белков
с ломощыо ядерной магнитной релаксации протонов воды.
Апробация работы, Основные результаты работы были долотены на XX Конференции молодых у'.еьых 'биологического факультета МГУ (Москва, 19В9), на VII и VIII Всесоюзных конференциях, "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (1989, 1990, Звенигород), на I Международном симпозиуме "Molecular organisation of biological structures" Москва, 1989).
Публикации. Результаты работы прі ставлены в семи публикациях.
Структура и об'ем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и содержит 168 страниц машинописного текста, включая З1 рисунок, 7 їаблиц и список цитируемой литературы из 13 наименований.