Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Особенности аминокислотного состава и структураколлагена (литературный обзор) 7
1. Аминокислотный состав коллагена и модельныхполипептидов 7
2. Структура коллагена и модельных полипептидов . 10
2.1. Полипролин П, полиглицин П 12
2.2. Соединения с трехспиральной структурой . 14
2.3. Вода и структура тройной спирали 17
2.4. Слоевые структуры 20
3. Инфракрасная спектроскопия коллагеновых соединений 22
3.1. Полоса амид А 23
3.2. Тонкая структура полосы амид I 25
4. Постановка задачи 32
Глава 2. Материалы и методы исследования 34
I. Материал 34
2. Гидратационные измерения ИК-спектров 34
4. Эффект сужения полос 38
5. Разложение контура полосы амид I на составлящие компоненты 40
Глава 3. Полоса амвд i и структура полипролина (Экспериментальные результаты) 44
Глава 4. Формирование трехспиральной структуры при увеличении длины полипептвдной цепи в ряду(Экспериментальные результаты 54
Глава 5. Тонкая структура полосы амвд и гетерогенность структуры водородных связей тройной спирали (гли-про-про) (экспериментальные результаты). 63
I. Денатурация Z -(гли-про-про)д - ОМе в водном растворе 64
2. Гидратация z -(гли-про-про)д - ОМе 68
3. Полоса амид I (гли-про-гли) 77
Глава 6. Обсувдение экспериментальных результатов 80
I. Особенности инфракрасных спектров коллагеновых соединений 80
1.1. Частоты колебаний амид I имидной связи 80
1.2. Мультиплетность полосы амид I коллагеновых соединений 80
2. Структура водородных связей модельных соединений и взаимодействие с водой 83
3. О структуре коллагена 86
Выводы 89
Литература 92
- Соединения с трехспиральной структурой
- Эффект сужения полос
- Полоса амвд i и структура полипролина (Экспериментальные результаты)
- Обсувдение экспериментальных результатов
Введение к работе
Белки группы коллагена образуют основную массу соединительной ткани и составляют около 30% всех белков организмов животных. Это один из самых распространенных в животном мире белков. Исследование коллагенов имеет большое значение в связи с такими важными общебиологическими проблемами, как биосинтез белка, старение, регенерация, а также для решения многих задач теоретической и практической медицины. Известна большая группа заболеваний, сопровождающихся изменениями соединительной ткани и входящими в ее состав коллагеновых волокон. Эти заболевания, к числу которых относятся радикулит, инфекционный полиартрит и другие, объединяются в группу "коллагеновых болезней". Практическая значимость исследований коллагенов связана также с его широким применением в некоторых отраслях промышленности (пищевая, легкая промышленность, кино- и фотопроизводство).
Все биологически важные функциональные свойства коллагена определяются его специфической молекулярной структурой, которая ответственна за формирование коллагенового волокна. Этот не катализируемый ферментами процесс осуществляется по принципу самосборки. В свою очередь, целый ряд особенностей структуры коллагена определяется его аминокислотной последовательностью, которая является регулярным политрипептидом гли-х-у, где гли-глицин, а х и у - амино- или иминокислота. Такая закономерность первичной последовательности натолкнула на мысль перенести исследования взаимосвязи структур различного уровня на искусственные политрипептиды. Впервые идея о структурной изоморфности таких политрипептидов и коллагена была высказана в 1957 году Н.С.Андреевой, а в I960 году В.А.Шибневым и В.Г.Дебабовым был
осуществлен синтез полимера (гли-про-оксипро) , полимерные цепи которого образуют структуру коллагенового типа. Синтез модельных соединений сыграл важную роль в исследованиях молекулярной структуры коллагена, изучение которой столкнулось с целым рядом трудностей и до настоящего времени не потеряло своей актуальности. Исследования модельных полипептидов показали, что для них характерной конформацией полипептидной цепи является вытянутая левая спираль типа полипролин II. В зависимости от аминокислотной последовательности и внешних условий такие спирали могут образовывать различные надмолекулярные комплексы, в том числе и тройную спираль коллагенового типа, различающиеся организацией структуры межцепочечных водородных связей. По-видимому, именно сетка водородных связей является в случае коллагена элементом, детерминирующим параметры его спирали и ограничивающим набор конформационных состояний. Это один из интересных вопросов в структурных исследованиях трехспиральной конформации, так как здесь мы сталкиваемся с принципиально иной организацией структуры водородных связей, чем в случае & -спирали или складчатого слоя, что и позволило сформулировать задачу настоящей работы как изучение структуры водородных связей ряда модельных соединений родственных коллагену методом инфракрасной спектроскопии.
Инфракрасная спектроскопия широко используется в изучении структур oi -спирали и складчатого слоя, однако применение этого метода в исследованиях коллагеновых соединений столкнулось с рядом трудностей, чем, по-видимому, и объясняется небольшое количество работ в этой области. В данной работе проведено исследование ИК-спектров полосы амид I ряда модельных соединений, характеризующихся различными формами надмолекулярной организации спиралей типа полипролин II, проведен анализ факторов, обуслов-
- б -
ливающих мультиплетный характер этой полосы. Исследованы этапы формирования трехспиральной структуры в процессе удлинения полипептидной цепи. Обсуждается роль воды в формировании структур полипролин П и тройной спирали.
Соединения с трехспиральной структурой
Следующим классом, в который в первую очередь входят нативные коллагены, являются соединения, образующие структуру тройной спирали. Не затрагивая истории развития модельных представлений, остановимся на трех моделях, составляющих основу современных представлений о структуре коллагена. Все эти модели предполагают структуру, состоящую из трех полипептидных цепей, каждая из которых в отдельности образует левоспиральную конформацию типа полипролин П. Три таких спирали, связанные межцепочечными водородными связями, закручиваются в одну пра-вовинтовую "супер-спираль" или тройную спираль коллагенового типа. Отдельные модели различаются между собой по взаимному расположению полипептидных цепей и, что более принципиально, по числу возможных водородных связей между цепями. Две модели, предложенные Ричем и Криком [97, 98], известные в литературе как "коллаген I" и "коллаген П", отличаются пространственной ориентацией пептидных ш- и СО-групп, а, следовательно, и ориентацией межпептидных водородных связей. Рисунок I иллюстрирует топологическое различие этих двух моделей. Поскольку обе модели предусматривают последовательность (гли-про-оксипро) и допускают образование только одной межпептидной водородной связи на трипептид, то их различие сказывается на том, СО-группы какого остатка в триплете будут участвовать в водородной связи.Модель Рамачандрана и Картха [94] сходна с предыдущимимоделями. Бе отличие состоит в величине проекции остатка нао ось спирали - 2,91 А (в предыдущих моделях проекция остатка о 2,86 А), кроме того, модель предполагает образование двухмежпептидных водородных связей на трипептидную единицу (рис.1). Одним из недостатков этой модели было то, что она не допускала присутствия иминокислотного остатка во втором положении в триплете, что противоречило экспериментальным данным. Чтобы преодолеть эту трудность, модель была изменена [93]. Для новой модели структура водородных связей предполагается не постоянной вдоль всей цепи, а меняется в зависимости от локализации иминокислотных остатков, причем на участках с последовательностью (гли-и-и), где и - иминокислота, она соответствует топологии "коллаген ІГ. В настоящее время не представляется возможным дать однозначный ответ о том, какой из вышеперечисленных моделей можно отдать предпочтение, поскольку попытки решить эту проблему методами изотопного замещения приводят к противоречивым результатам [68, 71, 120]. Не дают ответа на этот вопрос и данные по микрокалориметрии коллагенов [22J. Исследования модельных соединений показали физическую реальность модели Рича и Крика "коллаген П". В пользу этой структуры говорят и конформационные расчеты, выполненные В.Г.Туманяном [Пб]. Это единственный тип структуры, который с достоверностью был обнаружен для ряда полипептидов (см. таблицу 2). К числу таких полимеров в свою очередь относится (гли-про-про)п , достаточно хорошо изученный и ставший классической моделью тройной спирали [75, ИЗ, 117]. Присутствие двух иминокислотных остатков в триплете исключает возможность образования структуры, соответствующей модели Рамачандрана.Наиболее приемлемой моделью для этого образца является трой о ная спираль типа "коллаген П" с проекцией остатка 2,87 А.
Как уже отмечалось, полимеры с двумя иминокислотными остатками во втором и третьем положении в триплете образуют наиболее устойчивую коллагеновую конфигурацию, которая сохраняется в достаточно широком интервале внешних условий (температура, влажность и т.п.). Этот интервал существенно более узкий для полимеров (глицил-аминокислота-иминокислота). В работе В.Г.Туманяна и Н.Г.Есиповой [27] проводились конформационные расчеты с целью выявить факторы, которые определяют устойчивость кол-лагеновой структуры. Было показано, что существенная роль в унификации коллагеновой конфигурации отводится водородным связям, даже если они завязываются через молекулы воды. Анализ полученных результатов позволил авторам предсказать возможность возникновения коллагеновой структуры в гексапептиде (гли-про-про) , однако с большим конфигурационным набором. Рентгенографический анализ нонапептида (гли-про-про)д показал, что характер распределения интенсивности на рентгенограмме не оставляет сомнений в том, что тип структуры - коллагеновый Все молекулярные модели коллагена рассматривают воду в качестве необходимого структурного элемента.
Экспериментально показано, что дегидратация коллагенов сопровождается значительным нарушением нативной структуры [43, 114]. Роль воды в структуре тройной спирали обсуждается во многих работах [7, 8, 10, 43, 60, 92, 95]. В основном, все авторы придерживаются той точки зрения, что молекулы воды встраиваются в структуру тройной спирали и образуют водородные связи с карбонилами соседних цепей, неучаствующими в межпептидных связях. Такие водные мостики могут являться дополнительным фактором стабилизации коллагеновой структуры (рис.2). Однако вопрос о локализации молекул остается нерешенным. Неясно также, является ли структура водородных связей с водой детерминированной для различных соединений с трехспиральной структурой и насколько существенен ее энергетический вклад в стабилизацию тройной спирали. Исследования модельных соединений показывают, что те из них, которые образуют трехспиральную структуру, также обнаруживают гидратационный эффект, сопровождающийся структурными изменениями [56, 77, 78]. Эти изменения носят несколько иной характер, чем в случае природных белков. Дегидратация здесь не приводит к нарушению нативной структуры. Как показали исследования полимеров (гли-про-про)п , (гли-про-оксипро)п , (гли-оксипро-оксипро)п и других, эти образцы в сухом и гидратиро-ванном состоянии сохраняют трехспиральную структуру. При гидратации наблюдается уменьшение основного параметра спирали без изменения проекции остатка на ось спирали [19, 20].
Эффект сужения полос
При исследовании мультиплетной структуры полосы амид I модельных соединений таких, как поли (про), олигомеров (гли-про-про) , (гли-про-гли)п нами было обнаружено, что при прогревании образца (пленки) в атмосфере 100% относительной влажности D O до 80С и последующем охлаждении наблюдается сужение составляющих компонентов и соответственно увеличивается их спектральное разрешение (рис.7). Применение такой проце - 40 дуры облегчало процесс разложения спектров на составляющие компоненты. Этот эффект мы связываем с тем, что за счет увеличения подвижности полипептидных цепей при нагревании устраняются те дефекты в упаковке, которые возникли в процессе приготовления образцов. В то же время, прогревание полимера (гли-про-про и пленок коллагенов вызывает их денатурацию. Разложение контура полосы амид I на составляющие компоненты
Большинство исследований в области колебательной спектроскопии сталкиваются с проблемой разделения сложного контура спектральной кривой на составляющие компоненты. Однако на практике эта задача лишь в редких случаях допускает однозначное решение, например, в экспериментах, отвечающих требованиям метода Алленцева С30]. Наиболее часто при обработке спектральной информации используется процедура аппроксимации экспериментальной кривой набором аналитических функций, вариацией параметров которых добиваются максимального совпадения экспериментального и теоретического спектров. Такая методика, как правило, требует исходных предпосылок. Вопрос о форме изолированной полосы в инфракрасном спектре подробно рассмотрен в работе Сешадри и Джонса [24], где показано, что она описывается функцией Фойгта. На практике наиболее часто в качестве приближения Фойгтовской функции используют линейную комбинацию функций Гаусса и Лоренца [62] оптическая плотность полосы поглощения в максимуме;- положение максимума полосы поглощения;- полуширина полосы поглощения;К - коэффициент формы контура полосы поглощения.
Эту же функцию мы использовали в нашей работе. Для максимального устранения неоднозначности мы прибегали к ряду методических приемов: 1 - выбранные нами образцы имели простой химический состав, что снимало необходимость учета поглощения боковых радикалов; 2 - исследование кинетик дейтерообмена образцов показало возможность не учитывать вклад в спектр полосы амид I неупорядоченной формы; 3 - образцы имели наиболее хорошо разрешенный спектр полосы амид I, и это разрешение увеличивалось описанной выше процедурой температурной обработки; 4 - по возможности в образцах проводили полный дейтеро-обмен, чтобы избежать перекрытия полос амид I и амид П. Разложение спектра осуществлялось с помощью синтезатора кривых СК-2 (СКВ Ш АН СССР, Пущино). Полученные результаты мы использовали в качестве исходных для разделения спектра с помощью ЭВМ.
Машинная обработка проводилась на ЭВМ М4030 по методу Маркуадта [96]. Как правило, результаты разложения на синтезаторе кривых и с помощью ЭВМ достаточно хорошо совпадали. Точность совпадения экспериментальной и теоретической I " I і\ ссе « І нагни в. с і кривых составляла 1-2%, наибольшее расхождение наблюдалось в области 1600 см (5-7$). Это расхождение было характерно для всех исследованных нами образцов и его легко можно было устранить введением в этой области дополнительного компонента малой интенсивности. Однако мы не располагали сколь-нибудь достоверными данными о возможной природе этой полосы. Кроме того, нельзя исключать возможности асимметричности полос.
Поскольку в нашей работе впервые проводится анализ мульти-плетной структуры полосы амид I коллагеновых соединений, мы прибегали к процедуре разложения спектра на составляющие только в тех случаях, когда это представлялось нам достаточно очевидным, причем основная цель, которую мы приследовали, состояла в том, чтобы установить корреляции между наблюдающейся мультиплетностью полосы амид I и различными структурными формами исследуемых образцов. Поэтому мы в основном интересовались такими параметрами компонентов, как положение максимума и полуширина и в значительно меньшей степени формой контура и измерением интенсивности, так как их измерение требует точного определения толщины образца и исключения влияния неоднородности, чего трудно избежать при исследовании спектров пленок. В то же время, начинать такого рода исследования необходимо именно с пленок, поскольку только для них мы можем проводить соответствие спектральных данных конформационному состоянию образца, установленного методом рентгеноструктурного анализа. В работе мы предпочитали проводить исследование структуры полосы амид І в спектрах олигопептидов с достаточно большой длиной полипептидной цепи, чтобы избежать влияния полидисперсности, характерной для полимеров.
При этом необходимым требованием являлась их структурная и спектральная- 43 изоморфность полимеру, однако допускалась возможность ошибки в определении формы полос, связанной с конечной длиной цепи
Полоса амвд i и структура полипролина (Экспериментальные результаты)
Основной целью, которую мы преследовали, проводя исследования полипролина, было выяснение колебательных частот амид I, характерных для имидных групп в структуре вытянутой левой спирали полипролин П. На рисунке 8 приведены спектры полосы амид I сухой и гидратированной пленки полипролина П, подвергнутой тепловой обработке. В спектре гидратированной пленкитотчетливо наблюдается узкий пик с максимумом 1640 см х и плечоI тв области 1630 см . При дегидратации пик 1640 см"А не меняетсвоего положения, низкочастотный компонент исчезает, появляется отчетливое плечо в высокочастотной области. На этом же рисунке приведены результаты разложения полосы амид I.
Наблюдаемый эффект допускает достаточно однозначную интерпретацию. Компонент 1632 см в спектре гидратированного образца соответствует колебаниям СО-групп, взаимодействующих с молекулами воды, причем его значительная полуширина (44 см) говорит о том, что это взаимодействие носит нерегулярный характер. Обезвоживание приводит к разрыву водородных связей, что сопровождается исчезновением компонента 1632 см""1" и появлением нового - 1650 см , соответствующего свободному состоянию СО-групп.тНезависимость положения компонента 1640 см от гидратацион-ного состояния образца однозначно указывает на то, что этот компонент соответствует свободному, неводородносвязанному состоянию С0-групп, а его малая полуширина (12 см) свидетельствует о высокой степени упорядоченности этих групп в полипептидной цепи. Именно этому состоянию, по-видимому, соответствуют данные рентгеноструктурного анализа и поляризационные измерения, показывающие перпендикулярный дихроизм полосы амид I [52]» Тот факт, что компонент 1640 см не зависит от гидра-тационного состояния, говорит о том, что та часть молекул, полипептидные цепи которых находятся в упорядоченной конформации полипролин П, оказывается изолированной от взаимодействия с молекулами воды. Этот результат несколько неожиданней, так как взаимодействие с водой рассматривается как фактор стабилизации левоспиральной конформации.
Спектр полосы амид I водного ( В2о ) раствора полипролина существенно отличается от спектра пленки полипролин П. Корреляцию между этими спектрами удалось установить при исследовании температурной зависимости полосы амид I. На рисунке 9 приведены спектры этой полосы полипролина в растворе D20 при разных температурах. Видно, что, начиная с 40С, в спектре отчетливо появляется пик смаксимумом 1640 см , а исходный пик 1623 см уменьшается по интенсивности. Этот переход носит обратимый характер, изменение концентрации сказывается только на температуре, с которой он начинается. Существенным моментом является то, что спектр при температуре 80С полностью совпадает со спектром гидратированной пленки, соответствующим форме П полипролина (рис.10). Это совпадение, по-видимому, неслучайно. Ранее было показано, что продолжительное прогревание вызывает преципитацию полипролина, причем осажденный образец находится в форме П [44, 51, 59, 108].
Наш анализ полосы амид I при разных температурах показывает, что наблюдающиеся изменения не удается промоделировать перераспределением интенсивности компонентов 1623 см""1 и 1640 см . Такого рода эффект должен был бы наблюдаться, если с повышением температуры происходит образование новой кристаллической формы. область и уширяется, компонент 1640 см резко сужается и не меняет своего положения. Причем в процессе нагревания сохраняется интегральная интенсивность компонентов. Присутствие вспектре компонента 1640 см , соответствующего свободному состоянию СО-групп, указывает на то, что в растворе полипро-лин находится в агрегированном состоянии. При нагревании такие агрегаты объединяются в более крупные, которые, по сути дела, являются поликристаллами полипролина [4]. Этим объясняется неизменность интегральной интенсивности компонентов. Кристаллизация на уровне агрегационных комплексов приводит лишь к росту структурной упорядоченности полипептидных цепей, изолированных от контактов с молекулами воды, что выражается в уменьшении полуширины компонентов 1640 см. На наличие агрегатов в водном растворе полипролина указывают и данные работы [44]. По-видимому, именно агрегация является одним из факторов, обусловливающих существование высокоупорядоченной левоспиральной конформации полипролин П в водном растворе. Вода же является средой, в которой создаются условия для образования таких агрегационных комплексов. В этом плане представляют интерес данные по исследованию полипролина в растворе D20 + п-пропанол (1:9), где считается устойчивой конфор-мация полипролин I. На рисунке 12 приведен спектр полосы амид І в растворе D20 + п-пропанол. Полоса не обнаруживает мультиплетности, симметрична, а ее значительная полуширина
Обсувдение экспериментальных результатов
Частоты колебаний амид_1_имиднй_связи_ Наши исследования спектра полосы амид I полипролина показывают, что, действительно, частоты валентных колебаний СО-групп имидной связи сдвинуты в длинноволновую область по сравнению с частотами тех же колебаний амидной связи. Гидратиро ванным СО-группам соответствует частота 1632 см , а для сво т т бодных групп наблюдаются две частоты: 1640 см х и 1650 см ,причем первая соответствует упорядоченному состоянию, характеризуемому полушириной полосы 12 см . В спектре 2 -(гли-про-npo)g -ОМе свободному состоянию имидных СО-групп соответствует полоса 1640 см , гидратация вызывает смещение этой полосы до 1626 см . Мы не можем дать объяснения такому различию частот свободных групп, по-видимому, частота 1640 см обусловлена конформацией вытянутой левой спирали полипролин П. Появление низкочастотного компонента, связанного с колебаниями амид I имидной группы, следует ожидать в спектре биополимеров с высоким содержанием иминокислот, причем, в отличие от спектров образцов со структурой складчатого слоя, этот компонент должен сохраняться и в спектре неупорядоченной формы.ї льтишіетно ть полош ашщ I коллагеновых соединений Приведенные выше экспериментальные результаты позволяют сделать вывод, что основным фактором, определяющим мульти-плетность полосы амид I, является химическая и структурная неэквивалентность пептидных С0-групп. Эффект расщепления полосы амид I вследствие взаимодействия пептидных групп невелик.
В случае полипролина П, где отсутствует химическая и структурная гетерогенность СО-групп, упорядоченная структура характе тизуется одиночной полосой с максимумом 1640 см , причем эта полоса обнаруживает перепендикулярный дихроизм [52]. Отсюда можно заключить, что наблюдаемая полоса соответствует дважды вырожденному колебанию с симметрией Е. Аналогичный вывод делается в работе Кримма [76] относительно полосы амид І в спектре полиглицин П, где проводится сопоставление экспериментальных результатов с расчетами величины расщепления полосы амид І в результате взаимодействия пептидных групп и показано, что в спектре присутствует только перпендикулярная компонента Е типа. Для поли- и олиготрипептидов (гли-про-про) , (гли-про-гли) мы обнаруживаем в спектре полосы амид I проявление как химической, так и структурной неэквивалентности СО-групп. В спектре (гли-про-про) наблюдается один компонент, соответствующий колебаниям СО-групп, образующим межпептидные водородные связи СО.. .ш и два компонента, соответствующие СО-группам, взаимодействующим с молекулами воды, но различающимся по характеру пептидной связи на имидные и амидные. Полоса амид I (гли-про-гли) обнаруживает также три компонента, но в этом случае два из них связаны с колебаниями СО-групп имидной и амидной связей, образующих межпептидные связи, и одна соответствует СО-группам,водородносвязанным с молекулами воды. При этом спектр (гли-про-гли) не обнаруживает аномалии ни в положении полосы амид А, ни в положении компонентов полосы амид І, в то время, как для (гли-про-про) наблюдает-ся аномально высокочастотный сдвиг центрального пика 1665 см в спектре сухой пленки и полосы амид А, что характерно только для соединений с трехспиральной структурой [56, 77].Какие заклюения из этих данных можно сделать относительно спектра коллагена? Прежде всего, есть все основания утверждать, что полоса амид I коллагенов соответствует колебаниям неэквивалентных СО-групп трипептидной единицы. В спектре проявляется только компонент, соответствующий колебаниям с Е-симметрией - это показывает хорошо выраженный перепендику-лярный дихроизм полосы амид I [43]. По сравнению с политри-пептидами число неэквивалентных групп для модели "коллаген П" должно равняться 5, поскольку второе и третье положение в триплете (гли-х-у) может быть занято как амино-, так и имино-кислотами. Присутствие аминокислоты в положении х должно сопровождаться появлением полосы, соответствующей колебаниям карбонила C-J-OJ амидной связи, образующего водородные связи с водой в более высокочастотной области по сравнению с тем случаем, когда положение х занимает аминокислота. Возможно совпадение некоторых из этих 5 полос по частоте. В спектре политри- и полигексапептидов, у которых структура полосы амид I достаточно хорошо разрешена, отчетливо наблюдаются три компонента с частотами приблизительно такими же, как и для (гли-про-про) [56]. Три компонента наблюдаются и в спектре коллагена в растворе , где полоса амид I более узкая, чем в спектре пленки. Общим для всех этих спектров является присутствие низкочастотного компонента в области 1640 - 1630 см , который, согласно нашему анализу, соответствует имидному карбонилу CJOJ. Компонент в области 1690 - 1670 см"1 по аналогии с (гли-про-про) и (гли-про-гли) можно соотнести сколебаниями внешних CgOg групп связи у-гли. Однако, пока мы не располагаем данными, насколько велико различие в частотах амидного и имидного карбонилов, образующих межпептидные водородные связи в трехспиральной структуре, и существует ли оно вообще?
Непонятно, можно ли рассматривать центральную полосу как характерную для СО-групп, участвующих в межпептидных связях, или в нее также вносят вклад амидные карбонилы CJOJ. В целом, имеющихся данных пока недостаточно, чтобы дать стройную интерпретацию структуре полосы амид I коллагенов, которая, тем не менее, может быть получена при детальном анализе более широкого класса модельных соединений.
