Введение к работе
Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям (Фултон,1987; Moris,1982: Pachter.1984 и др.)цитоскелет живых клеток представляет собой динамическую, тонко организованную систему, в значительной степени определяющую структуру клеток и их функциональные свойства. Состояние цитоскелетных элементов прежде всего обуславливает чрезвычайное многообразие формы и размеров нейронов с характерными дендритными и аксонными отростками; геометрические же характеристики нервных клеток тесно связаны с их физиологическими характеристиками. Сократительные элементы цитоскелета принимают участие в цитоплазыатическом транспорте различных веществ по нейрону; цитоскелет важен тем, что он поддерживает ростовые процессы в клетке, а также участвует в клеточной миграции в развивающемся мозге. Цитоскелетом определяется способность клетки прикрепляться к субстрату и образовывать контакты с другими клетками, свобода её передвижения. Усложнение структуры нейронов и приобретение ими окончательной "взрослой" формы в период пре-и раннего постнатального развития обуславливаются, очевидно, как генетической программой, присущей данному нейрону, так и функциональным взаимодействием с соседними клетками. Поскольку форма и размер нервной клетки определяются состоянием цитоскелетных элементов, то в основе изменения этих показателей в ходе развития лежат процессы, происходящие в цитоскелете. Поэтому очевидно, что изучение структуры нервных клеток и её изменений в процессе диф-ференцировки очень важно для понимания морфофункциональных свойств нейронов.
Большинство работ по изучению цитоскелета живой клетки проведено на нормальных пролиферирующих. или трансформированных линиях клеток (Свиткина и др.,1983; isenberg, 1978; Olmsted, 1984и др. ) Изучению цитоскелета в нейронах посвящено небольшое количество работ и проблема изучена недостаточно.
Каждый тип клеток имеет свой особый спектр цитоскелетных белков, присутствующих в определенном соотношении на различных стадиях развития и специфическим образом расположенных. Изменение структуры элементов цитоскелета в нейронах приводит к значительным нарушениям функции клеток, что проявляется в возникновении различных патологических состояний тканей и органов (напр., болезнь Альцгей-мера, скрэпи, куру и др.).
На основании физико-химических и биохимических исслчдопанки
- г -
были сделаны выводы о том, что с цитоекелетными элементами взаимодействуют определенные мембранные белки, относящиеся к разряду интегральных, обладающих латеральной подвижностью ( Flanagan, 1978; Ojakian; 1988 ). Известно, что большинство белков и липидов поверхностной мембраны гликозилированы ( Koszinowski, Kramer, 1981 ). Гликопротеины и гликолипиды поверхностной мембраны объединяются термином гликоконыогаты. Углеводные детерминанты, распределение которых на поверхности клеток меняется в процессе дифференцировки, играют важную роль во взаимодействиях развивающихся клеток. Предполагают, что характер взаимодействия гликоконьюгатов мембраны с элементами цитоскелета может изменяться в процессе дифференцировки клетки ( Prives et.al.1982 ). Поэтому изучение распределения углеводных детерминант, определённой специфичности и характера их связи с сократительными элементами представляют особый интерес для понимания клеточных механизмов нейроонтогенеда.
В нервных клетках предполагается специфическая функция фибриллярных структур - участие в процессе поддержания электрической возбудимости клеточной мембраны ( Matexmoto, 1979; Fukuda, 1981 ). Однако, характер и механизмы этой связи выяснены ещё недостаточно*
Цель работы состоит в изучении распределения цитоскелетных элементов нервных и глиальных клеток на различных этапах дифференцировки и исследовании функциональной связи элементов цитоскелета с компонентами поверхностной мембраны нейрона.
Главные задачи.
-
С помощью моноклональных антител к цитоскелетным белкам изучить состав и распределение элементов цитоскелета интактных клеток эмбрионального спинного мозга в процессе развития.
-
Провести цитофотометрический анализ количественного содержания белков цитоскелета в различных отделах нейрона, на различных стадиях развития ив различных типах клеток.
3.Изучить ультраструктурные характеристики патологических изменений клеток после воздействия цитохалазина и колхицина, веществ, специфически разрушающих микрофиламенты и микротрубочки соответственно .
4. Исследовать изменения распределения гликоконьюгатов поверхностной мембраны, используя меченные коллоидным золотом лектины, при разрушении элементов цитоскелета.
Научная новизна и практическая ценность работы. Данные, полученные в настоящей работе, существенно дополняют представления о пространственной организации цитоскелета в нервных и глиальньгх клетках. Показан характер распределения ыикротрубочек, микрофиламентов и нейрофиламентов нервной клетки в процессе её дифференцировки. Впервые был проведен количественный анализ содержания цитоскелетных белков в различных участках клетки в процессе дифференцировки и сравнение их содержания в различных типах клеток.
Обнаружено, что в культивируемых нейронах скопления актина локализуются не только в дистальних участках растущих нейритов, но и на протяжении отростков в области соединения их с субстратом, что может иметь значение и для установления межклеточных контактов.
Продемонстрировано, что в молодых развивающихся нервных клетках и в активно растущих отделах нейронов преобладают лабильные элементы цитоскелета, что может отражать один из механизмов формообразования у нейронов.
Показано, что несмотря на возможность небольшого прироста ту-булина за счет вновь синтезируемого, общее его количество в течении жизни клетки остается примерно постоянным. Происходит лишь перераспределение тубулина внутри клетки, связанное, вероятно, с активным процессом роста отростков.
Выявлена различная чувствительность нервных и глиальных клеток к агентам, разрушающим цитоскелетные структуры, кроме того, нейроны на различных стадиях развития по-разному реагировали на такие экспериментальные воздействия.
Получены новые данные, свидетельствующие о неодинаковой степени участия микротрубочек и микрофиламентов в процессах латеральной подвижности и асимметричном распределении гликоконыогатов поверхностной мембраны нейронов в различных отделах клетки и на разных стадиях развития.
Известно, что ряд заболеваний центральной нервной системы, например, болезнь Альцгейыера, связан с нарушением структуры цитоскелетных элементов нейронов. До настоящего времени вопрос о причинах возникновения этого заболевания и способах лечения остается нерешенным. Один из путей исследования - разработка модельных систем, основанных на выявленных патологических изменениях и учитывающих причины, которые могут их вызвать. Морфологическая картина патологических изменений клеток после воздействия определенных доз колхицина и при болезни Альцгеймера аналогичны, что дает розмож-
ность предполагать определенное сходство механизмов,лежащих в основе возникновения указанных патологий и использовать предлагаемую нами модель для изучения патогенеза этого заболевания.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на семинарах секции Нейрофизиологии Института физиологии им. А.А. Богомольца АН УССР (Киев,,1986-1990), ІУ Всесоюзной конференции по патологии клетки (Москва, 1987), ІУ Международном конгрессе по клеточной биологии (Монреаль, 1988, Канада), II Всесоюзном симпозиуме "Возбудимые клетки в культуре" Шущино-на-Оке, 1989), Республиканской конференции "Применение Электронной микроскопии в медицине" (Ивано-Франковск, 1989), Международном симпозиуме "Функций нейро-глии" (Тбилиси,1989), УІІІ Европейском конгрессе по нейрохимии (Лейпциг, 1990, ГДР)-
, Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, б глав (I глава-обзор литературы, 2 глава-методы исследования, 3<-5 главы- результаты собственных исследований, 6 глава-обсуждение полученных результатов ), выводов и списка литературы, содержащего 162 наименований. Работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 рисунками, ,6 таблицами
Моделью для изучения структурных характеристик элементов цито-скелета служили клетки диссоциированного спинного мозга и спиналь-ных ганглиев 12-14 дневных мышиных эмбрионов, развивающиеся в условиях монослойных культур. Культивирование проводили в среде, состоящей из минимальной среды Игла (50%),сыворотки плодов крупного рогатого скота (35%), эмбрионального 'экстракта (9%), сбалансированного солевого раствора Хенкса (5%), глюкозы (25мМ), инсулина (0,2 ед/ мл). Покровные стекла, покрытые 0,01% поли-Ъ-лизином или коллагеном, содержащие 1-2 капли клеточной суспензии, монтировали в камере Максимова или помещали в С02~инкубатор (95% воздуха и 5% COg? температура 35,5С; влажность 90%). .
Изучение распределения элементов цитоскелета в клетках проводили с помощью иммунофлуоресцентного анализа с использованием моно-клональннх антител к основным цитоскелетным белкам: актину, тубулнну белку пейрофипаментов, глиалыюму кислому фибриллярному белку. Ппкропш-'ч стгм;ля,с растущим на них монослоем клеток, отмывали от
питательной среды в солевом растворе и помещали в экстрагирующий раствор с 1% Тритона Х-100. Затем клетки инкубировали с меченными антителами. Для визуализации различных белков цитоскелета в одной клетке использовали двойное окрашивание при помощи пар ыоноклональ-ных антител, меченных флуоресцеинизотиоцианатом и родамином. Микроскопию флуоресцирующих клеток проводили посредством фотомикрос-копа " ОИШ " (ФРГ)с набором соответствующих фильтров..Подсчет количества хромофора производили с фотопленки с помощью прибора "Морфоквант". Относительное количество хромофора определяли по формуле, выведенной из закона Бугера-Ламберта-Беера:
ЕС = zlB^sbj , где
КС-относительное количество хромофора, I-интенсивность падающего светового пучка, 1о- интенсивность пучка после прохождения через фо-тометрируемое поле, 1- толщина объекта.
Для ультраструктурного исследования в просвечивающем ЭМ культуры фиксировали в 2% растворе глютаральдегида, дофиксировали 1% 0S0. на фосфатном буфере /рН ?,4/, обезвоживали и заключали в Аралдит. Ультратонкие срезы, контрастированию уранилацетатом и лимоннокислым свинцом, просматривали в электронном'микроскопе jem-юо сх
Для изучения распределения гликоконьюгатов поверхностной мембраны культивируемых клеток использовали коньюгированные с коллоидным золотом лектины, которые обладают свойством специфически связываться с углеводными детерминантами строго определенной структуры. В работе использовали лектины: wga - агглютинин завязи пшеницы тгШсит vulgaris , углеводная специфичность - N -ацетил-Д-глюкозаыин и N-ацетилнейраминовая кислота; и нрь -агглютинин из белочной железы виноградной улитки Helix pomatia , углеводная специфичность - n -аце-тил-Д-галактозаыин. Для количественного определения закономерностей топографии поверхностных гликоконьюгатов проводилась статистическая обработка распределения гранул-маркеров с помощью анализатора изображений типа М0Р-АМ03 /фирма Рейхерт, Австрия/ и ЭВМ ИВК СМ-4.
, Для исследования связи элементов цитоскелета с компонентами поверхностной мембраны использовали вещества, избирательно разрушающие микротрубочки (МТ -колхицин или микрофиламенты (МФ)-цитохалазин.
- б -