Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Индукционные процессы при фотосинтезе 9
1.1.1. Последовательность событий вовремя индукции 10
1.2. Регуляция фотосинтеза во время индукционных явлений 13
1.2.1. Светозависимая регуляция 13
1.2.1.1. Активация ферментов на свету 13
1.2.1.2. Влияние спектрального состава света 15
1.2.1.2.1. Активация циклического электронного транспорта 15
1.2.1.2.2. Миграция светособирающего комплекса 16
1.2.2. Регуляция в системе взаимосвязанных биохимических реакций 18
1.2.2.1. Переключение электронного нециклического транспорта на циклический 18
1.2.2.2. Автокатализ 20
1.2.3. Влияние транспорта метаболитов на регуляцию фотосинтеза 21
1.3. Замедленная миллисекундная люминесценция и ее применение 26
1.4. Темперптурные изменения кинетических характеристик фотосинтеза 28
1.4.1. Влияние высоких температур на отдельные стадии фотосинтеза 29
1.4.1.1. Первичные процессы фотосинтеза и электронный транспорт 29
1.4.1.2 Темновые реакции фотосинтеза 32
1.4.2. Влияние низких температур на отдельные стадии фотосинтеза 33
1.4.2.1. Первичные процессы фотосинтеза и электронный транспорт 33
1.4.2.2. Темновые реакции фотосинтеза 35
1.4.2.3. Влияние разных режимов охлаждения и нафевания на фотосинтетическую активность 36
1.5. Теоретические модели и регуляторные механизмы фотосинтеза 37
1.6. Постановка задачи 40
2. Описание методов рассчетов и экспериментальных методик 41
2.1. Описание модели используемой для интерпретации экспериментальных результатов 41
2.1.1. Описание первичных процессов (поглощение и излучения света, процессы дезактивации и миграции возбуждения, разделения зарядов и электронный транспорт) 41
2.1.2. Учет псевдоциклического потока электронов в ФС1 и окисление кислородом переносчиков электроном между ФС 46
2.1.3. Производство АТР в световой стадии фотосинтеза расход АТР в цикле Кальвина 47
2.1.4. Описание восстановительного пентозофосфатного цикла 47
2.2. Методика эксперимента 50
2.2.1. Объекты исследования 50
2.2.1.1. Выделение хлоропластов 50
2.2.1.2. Контроль состояния хлоропластов 52
2.2.1.2.1. Измерения фотоиндуцированных изменений величины сигнала ЭПР 1 52
2.2.1.2.2. Исследование кинетики фотоиндуцированных изменений сигнала ЭПР спиновой метки (ТЕМПОамина) 55
2.2.1.2.3. Изучение кинетики рН при фосфорилировании 55
2.2.2. Регистрация кривых медленной индукции люминесценции 56
3. Экспериментальное исследование миллисекундной замедленной люминесценции при различных температурных режимах 60
3.1. Контроль состояния хлоропластов 60
3.1.1. Измерения фотоиндуцированных изменений величины сигнала ЭПР 1 60
3.1.2. Исследование кинетики фотоиндуцированных изменений сигнала ЭПР спиновой метки (ТЕМПОамина) 63
3.1.3. Изучение кинетики рН при фосфорилировании 65
3.2. Исследования температурных зависимостей параметров замедленной люминесценции 67
3.2.1. Экспериментальное изучение температурных зависимостей параметров замедленной люминесценции 67
3.2.1.1. Температурные зависимости параметров замедленной люминесценции на листьях китайской розы 67
3.2.1.2. Температурные зависимости стационарного значения замедленной люминесценции хлоропластов китайской розы и бобов 73
3.2.1.3. Температурные зависимости стационарного значения замедленной люминесценции листьев китайской розы, влияние ингибиторов 75
3.2.1.4. Влияние режимов охлаждения и нагревания на стационарное значение замедленной люминесценции 77
3.2.1.5. Влияние криопротекторов на температурную зависимость замедленной люминесценции в области низких температур 81
3.2.2. Теоретическое описание температурной зависимости полученного экспериментально стационарного значения замедленной люминесценции 82
3.2.2.1. Выбор констант скоростей и других параметров модели для описания экспериментальных результатов 82
3.2.2.2. Выбор температурных зависимостей элементарных констант скоростей для использования в теоретической модели 84
3.2.2.3. Сравнение теоретических и экспериментальных результатов 86
Основные результаты и выводы 88
- Регуляция фотосинтеза во время индукционных явлений
- Темперптурные изменения кинетических характеристик фотосинтеза
- Методика эксперимента
- Исследования температурных зависимостей параметров замедленной люминесценции
Введение к работе
В настоящее время считают, что мировых запасов нефти хватит приблизительно на 50 лет, а угля приблизительно на 300 лет. Это те самые сроки, за которые человечество должно научиться использовать углерод создаваемый в ходе современного фотосинтеза, а не протекавшего в прошлом и доставшегося нам по наследству в виде запасов ископаемого топлива. Для достижения этой цели вряд ли будет достаточно современного сельского* хозяйства, по крайней мере, в той форме, в которой оно существует сегодня, поскольку на получение урожая расходуется, как правило, больше энергии, чем содержание энергии в виде химических соединений в самом урожае. В связи с этим представляется очень важным экономия органического топлива и детальное изучение процессов фотосинтеза как для применения в сельском хозяйстве, так и для создания искусственных систем, синтезирующих органические вещества.
Фотосинтез является уникальным природным процессом, который под действием лучистой энергии позволяет фиксировать атмосферный углекислый газ, синтезировать органические вещества, и выделять в атмосферу кислород.
Фотосинтез представляет собой окислительно-восстановительную реакцию. Вода окисляется в результате удаления водорода и выделении кислорода, двуокись углерода восстанавливается до уровня углевода. Уже хорошо известны структура фотосинтетического аппарата и основные реакции в фотосинтезе. Разрешение вопроса о взаимодействиях этих реакций еще остается выясненным не до конца. Успешную жизнедеятельность клетки или организма в целом определяют именно регуляторные механизмы. В основе регуляции лежит изменение ферментативной активности, действие масс (влияние
концентрации метаболитов) и транспорт (передвижение метаболитов между хлоропластом и его клеточным окружением). В настоящее время для регуляции со временами до десятков минут известны следующие механизмы: перенос в мембране подвижного светособирающего комплекса от ФС2 к ФС1, переключение между нециклическим, циклическим и псевдоциклическим электронным транспортом, распределение запасаемого углерода между крахмалом и сахарозой. Изучение процессов индукции, перехода адаптированного в темноте фотосинтезирующего организма к стационарному фотосинтезу после включения возбуждающего света, позволяет гораздо лучше понять механизмы регуляции. В настоящее время индукция широко применяется для изучения фотосинтетического аппарата, несмотря на искусственный процесс в том отношении, что более или менее внезапный переход растений или листьев после довольно длительных периодов темноты в условия яркого освещения в природе встречается довольно редко. Часто используется индукция замедленной миллисекундной люминесценции, прежде всего в связи с простой ее регистрации. На индукционные кривые оказывают влияние внешние факторы, такие как температура, газовый состав среды, различные ингибиторы и разобщители электронного транспорта, реакций цикла Кальвина и транспорта ассимилированного углерода. Влияние температурных режимов на индукционные кривые дает больше информации для исследователей, поскольку позволяет лучше понять механизмы регуляции и взаимосвязь между хлоропластом и клеткой. Известно, что индукция не очень сильно зависит от интенсивности освещения, однако на нее сильно влияет температура. Скорости биохимических реакций обычно удваивается при каждом увеличении температуры на 10 С. Скорости первичных реакций фотосинтеза практически не зависят от температуры. Поскольку биохимические
реакции регуляторно связаны с фотохимическими, следовательно, зависимость ЗЛ от температуры дает более полную информацию о процессе фотосинтеза в целом.
К сожалению, в настоящее время все еще представляется сложным разделить вклады различных регуляторных механизмов, что затрудняет интерпретацию экспериментальных результатов. Только сравнение экспериментальных данных с теоретическими, полученными в рамках количественной теории фотосинтеза, позволяет интерпретировать экспериментальные результаты.
Целью настоящей работы является экспериментальное и теоретическое исследование интенсивности замедленной люминесценции от температуры при разных режимах охлаждения и нагревания фотосинтезирующих объектов. Для объяснения полученных экспериментальных результатов была применена созданная ранее и дополненная теоретическая модель фотосинтеза, включающая поглощение света молекулами пигментов, перенос возбуждения на реакционный центр, разделение на нем зарядов, циклический, нециклический и псевдоциклический электронный транспорт, фотофосфорилирование, основные реакции цикла Кальвина.
Регуляция фотосинтеза во время индукционных явлений
Одной из причин индукции является светозависимая активация ферментов восстановительного пентозофосфатного цикла и их дезактивация в темноте. Некоторые из ферментов цикла (РуБФ- карбоксилаза, фосфоглицераткиназа, фосфорибулокиназа, НАДФН- гл ицерал ьдегидфосфатдегидрогеназа, фруктозо-1,6-бисфосфатаза) являются "светоактивируемыми", то есть в экспериментах in vitro было обнаружено увеличение их активности при включении света. Каким образом это увеличение активности связано с увеличением интенсивности света, а также, в какой мере оно может определять длительность индукционной лаг-фазы, для некоторых из указанных ферментов остается не вполне ясным [6]. Можно выделить несколько механизмов светозависимой активации ферментов.. Во-первых, это увеличение активности ферментов при вызванном светом защелачивании стромы. Во-вторых, это ферредоксинтиоредоксиновая система. Регуляторный белок - тиоредоксин восстанавливается конечным акцептором электронов после фотосистемы 1, ферредоксином, и затем, взаимодействуя с ферментом, восстанавливает его тиоловые группы, переводя фермент из неактивного состояния в активное. К ферментам цикла Кальвина, активируемым тиоредоксином, относятся прежде всего, фосфорибулокиназа (ФРК) и фруктозо-1,6-бисфосфатаза (ФБФаза), а также рибузозобисфосфаткарбоксилаза (РБФК). Последний фермент активируется тиоредоксином не непосредственно, а через "посредника", рубиско-активазу [7]. Механизм воздействия тиоредоксина на активируемые им ферменты продолжает активно исследоваться. Так, в недавних работах было показано, что в формировании комплекса тиоредоксина с ФБФ-азой существенную роль играет электростатическое притяжение [8]. Для другого активируемого тиоредоксином фермента, НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы, на основании рентгеноструктурного анализа был предложен механизм тиоредоксиновой активации. Оказалось, что малатдегидрогеназа в неактивной форме содержит два S-S мостика, один из которых образует дополнительную сшивку между двумя ее субъединицами, а второй прижимает С-конец фермента к его поверхности, закрывая доступ к месту присоединения субстрата. Авторы указывают, что восстановление этих дисульфидных связей тиоредоксином открывает субстрату доступ к активному центру фермента и возвращает белку необходимую для его нормального функционирования подвижность [9]. Есть указания на то, что тиоредоксиновая система является не единственной системой редокс-зависимой активации ферментов цикла Кальвина.
Так, в работе Веделя с соавт. [10] показано, что регуляторный белок СР12 может образовывать комплексы с двумя ферментами пентозофосфатного цикла, НАДФН-глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназой и фосфорибулокиназой, снижая их активность. Инкубация комплексов с НАДФ и НАДФН приводила к их диссоциации, что позволило авторам сделать вывод о том, что СР12 может также участвовать в редокс-зависимой активации ферментов цикла Кальвина. 1.2.1.2. Влияние спектрального состава света Как известно, существуют спектральные различия фотосистем: ФС 1 получает энергию в основном от длинноволновых компонент хлорофилла а с максимумом поглощения при длинах волн, больших 680 нм, тогда как ФС 2 связана с более коротковолновыми формами хлорофилла а с максимумами при X, 680 нм [11, 12]. В настоящее время существует два основных механизма регуляции фотосинтеза при изменении спектрального состава возбуждающего света: циклический электронный транспорт и миграция светособирающего комплекса. 1.2.1.2.1. Активация циклического электронного транспорта Одним из механизмов, способствующих приспособлению растения к внешним условиям и участвующих в регуляции фотосинтеза при освещении различного спектрального состава, является активация циклического электронного транспорта вокруг ФС 2 [13]. При возбуждении светом 1 (светом, поглощаемым преимущественно фотосистемой 1)скорость окисления Р700 будет превышать скорость его восстановления, цепь электронных переносчиков между фотосистемами будет окислена, а концентрация Р700+ велика. Увеличение концентрации Р700+ стимулирует циклический электронный транспорт вокруг фотосистемы 1 и восполнит недостаток АТФ, вызванный невысоким уровнем линейного переноса электронов между фотосистемами 1 и 2. В случае преимущественного возбуждения фотосистемы 2 (свет 2), напротив, линейный отток электронов от фотосистемы 2 ограничен отсутствием Р700+, что приводит к восстановлению цепи электронного транспорта между фотосистемами, которое может быть частично уменьшено циклическим транспортом вокруг фотосистемы 2. Эти рассуждения подтверждаются результатами работы А.С. Андреевой [14]. В работе исследовалась зависимость отношения максимума к стационару Fm/Fs, для кривых индукции люминесценции при возбуждении синим светом А,=404 нм от интенсивности предварительного освещения дальним красным светом А,=725 нм. Показано, что по мере увеличения интенсивности предосвещения отношение Fm/Fs сначала медленно возрастает, а затем резко снижается. Увеличение Fm/Fs с увеличением интенсивности освещения при небольших ее значениях автор объясняет тем, что после выключения синего действующего света цепь электронного транспорта между фотосистемами не полностью окислена, и включение красного света способствует полному окислению электронных переносчиков между фотосистемами за счет электронного транспорта на Р700+. С увеличением интенсивности предосвещения начинает возникать описанный выше дисбаланс между скоростью окисления и восстановления Р700 и активируется циклический электронный транспорт вокруг фотосистемы 1. Дальнейшее увеличение интенсивности предосвещения приводит к восстановлению пула пластохинонов, ингибированию линейного электронного транспорта между фотосистемами и уменьшению отношения Fm/Fs. Изменение окислительно-восстановительного состояния пластохинонового пула при предварительном освещении различного спектрального состава было показано на листьях в работе В.А. Караваева и А.К.
Кукушкина [15] методом быстрой индукции люминесценции. 1.2.1.2.2. Миграция светособирающего комплекса Вторым механизмом регуляции фотосинтеза при изменении спектрального состава возбуждающего света является т.н явление «переливания» (Eng. spillover), т.е. перенос энергии возбуждения из фотосистемы 2 в фотосистему 1 при преимущественном возбуждении фотосистемы 2. В 1969 году Мюрата и, одновременно с ним, Бонавентура и Майерс показали, что in vivo существует механизм, обеспечивающий сбалансированное возбуждение фотосистем [12]. Авторы предположили, что в присутствии ионов магния происходит изменение структуры пигментной матрицы, приводящее к перераспределению света между фотосистемами. В связи с этим Мюрата ввел понятия "состояние 1" и "состояние 2" пигментного комплекса в зависимости от того, какой фотосистеме преимущественно отдается энергия. В более поздней серии работ Беннетта и Аллена было показано, что переход из состояния 1 в состояние 2 осуществляется посредством обратимого фосфорилирования подвижного светособирающего комплекса фотосистемы 2, регулируемого окислительно-восстановительным состоянием пластохинона [16]. Считается, что фосфорилированный ССК 2 отделяется от фотосистемы 2, с которой он был связан (состояние 2) и мигрирует к реакционному центру фотосистемы 1 (состояние 1). Переход между состояниями in vivo был показан как при переходах между возбуждениями на длинах волн, преимущественно поглощаемых фотосистемами 1 и 2 (дальний красный, 710 нм - красный, 645 нм) [16], так и при переходе от темноты к широкополосному возбуждению белым или красным светом [17] или между возбуждениями широкополосным синим и красным светом (хроматические переходы, см., например [18]. Результаты цитировавшейся выше работы [14] не могут быть связаны с переносом ССК 2. Время записи кривой индукции люминесценции в этой работе не превышало 3 минут, в то время как характерное время фосфорилирования и переноса подвижного ССК 2 в тилакоидной мембране 7 -10 минут [19, 16, 20]. Как отмечалось выше, они связаны с увеличением циклического электронного транспорта. В заключение отметим, что два основных механизма регуляции фотосинтеза при изменении спектрального состава возбуждающего света, циклический электронный транспорт и миграция светособирающего комплекса, тесно связаны между собой через окислительно-восстановительное состояние пластохинонового пула.
Темперптурные изменения кинетических характеристик фотосинтеза
Температура влияет на все биохимические реакции, участвующие в процессе фотосинтеза, Суммарный ответ на изменение температуры, проявляющийся в поглощении СОг достаточно сложен. Разумно предположить, что скорости отдельных реакций фотосинтеза более или менее сбалансированы в некотором диапазоне температур, который можно считать нормальным для данного генотипа и при данных условиях выращивания [41]. Если температура выходит за пределы этого диапазона, то скорости отдельных реакций могут снижаться и становиться лимитирующими. Для разных видов растений характерны разные области изменения температуры, в которых влияние температуры на растение обратимо [22]. 1.4.1. Влияние высоких температур на отдельные стадии фотосинтеза 1.4.1.1. Первичные процессы фотосинтеза и электронный транспорт При увеличение температуры происходит уменьшение активности ФС2, снижение скорости электронного транспорта и активности водорасщепляющего комплекса. Активизируется циклический транспорт вокруг ФС 1, которая является более термостабильной. При дальнейшем увеличении температуры, происходят необратимы изменения, связанные с выходом части белков ФС2 из мембраны и структурными изменениями некоторых трансмембранных белков. Продолжительное освещение мембран тилакоидов при 40С приводит к полному ингибированию ФС2. Иммунный анализ по белкам ФС 1, ФС2, cytb6f, и АТФ-синтетазы, показал, что вне мембраны появляются только белки ФС2, а все остальные остаются на месте [42]. Авторы предполагают, что выделение части белков связано с высокотемпературным повреждением водорасщепляющего комплекса. В работах [43, 44] изучали нарушения в тилакоидах при равномерном нагревании от 25 до 50С. В тилакоидах табака [43] кислород-выделяющий комплекс ингибировался при температуре между 32 и 45.
Между переменной флуоресценцией и выделением кислорода авторы наблюдали задержку и пришли к выводу, что это связано с возможными переходами между S состояниями водорасщепляющего комплекса после его ингибирования в целом. В то же время при этих температурах акцепторная часть ФС2 все еще остается стабильной. При повышении температуры приблизительно до 50С происходит диссоциация белковой матрицы светособирающего хлорофилла из ФС2 [45] тем самым уменьшается миграция энергии в РЦ. В работе [46] также замечено, что увеличение максимального значения люминесценции связано с денатурацией белковой матрицы хлорофилла. Происходит частично обратимое отделение части антенны от ФС2. Подобное увеличение люминесценции было изучено в работах [47, 48, 49] Температура, при которой происходит быстрое увеличение люминесценции, часто используется как показатель термостабильности ФС2.[50] Возможно, что эти изменения связаны с выходом из ядра комплекса ФС2 стабилизирующего белка ФС2(33 кДа) при температуре около 40С [46]. При температурах выше 40С [51] происходит необратимое отделение минорного антенного комплекса, что приводит к уменьшению квантового выхода в результате снижения скорости разделения зарядов, увеличению скорости обратных реакций вследствие увеличения скорости рекомбинации и снижения эффективности стабилизации зарядов. Большую роль в увеличении люминесценции при высоких температурах, кроме диссоциации антенных комплексов хлорофилла а и b от реакционного центра ФС2 и инактивации ФС2, играет темновое восстановление QA пластохиноном [46] Обнаружено изменение относительных концентраций хинонов QA И QB при высоких температурах [47]. Увеличение выхода люминесценции вследствие восстановления QA зависит от вида растения [46]. Обратимость высокотемпературного восстановления QA указывает на то, что ферменты, участвующие в этом процессе, активизируются при высокой температуре, а при комнатной температуре переходят в менее активное состояние. При повышении температуры скорость электронного транспорта от QA к QB постепенно уменьшается [43]. Авторы считают, что эти явления вызываются высокотемпературными структурными изменениями трансмембранных белков Dj, D2. При 50 С электронный транспорт между QA И QB необратимо прерывается. Авторы в работе [52] показали, что при высоких температурах, когда ФС2 ингибируется, активизируется циклический транспорт вокруг ФС1, что при температурах около 40 С позволяет удерживать протонный градиент мембраны тилакоида на должном уровне. При повышении температуры обнаружили: увеличение степени фосфорилирования белков ФС2 [53], изменение баланса энергии в сторону ФС1, активизацию ФС1 и связанного с ней электронного транспорта [54]. Это, по-видимому, является механизмом приспособления растения к высоким температурам. Результаты этих работ позволяют прийти к заключению, что нагревание влияет на организацию мембранных белков (хлорофилл-белковых комплексов, белков реакционных центров, систему выделения кислорода). Рэйсон и Берри [55, 56] сообщают о том, что толерантность мембран ФС2 к действию температуры зависит от текучести липидов in vivo.
Изменения в среде суспендирования, замена D20 на Н20, увеличивающие термостабильность растворимых белков, повышают также термостабильность хлорофилл-белковых комплексов мембран хлоропластов [57]. Эти результаты показывают, что при температурной денатурации по всей видимости, происходят изменения во взаимодействии пептидных цепей с водой, раскручивание спиралей. 1.4.1.2 Тем новые реакции фотосинтеза Скорости реакций цикла Кальвина зависят от концентрации субстратов, ферментов и их активности [22]. Они меняются с температурой, в этом смысле фермент РуБФ карбоксилаза является наиболее изученным. На свету происходит активация этого фермента при помощи активазы РуБФ карбоксилазы. Авторы [58] изучали процесс ингибирования данной активазы при повышении температуры. Для разных растений ингибирование происходит при различных температурах [58, 59, 60], для большинства это ингибирование обратимо до температуры 40 С. При более высоких температурах происходят структурные изменения активазы. Подавление активазы также коррелирует со снижением скорости фиксации СОг [61]. В ответ на снижение активации РуБФ карбоксилазы происходит увеличение транстилакоидного градиента рН [61]. Высокие температуры также ингибируют саму РуБФ карбоксилазу, при этом происходит ее обратимая модификация. Авторы [62] говорят о защитном механизме, позволяющем тем самым предотвратить более серьезные повреждения. Другим важным результатом действия температуры является изменение фотодыхания и потребностей энергии для чистой фиксации СОг в реакциях Сз метаболизма. При повышении температуры стимулируется темновое дыхание и, следовательно, снижается поглощение СОг-Усиление темнового дыхания сильно отражается при низких интенсивностях света, но при скоростях фотосинтеза, наблюдаемых в условиях светового насыщения, дыхание относительно мало, соответственно не оказывает существенного влияния на температурную зависимость чистого фотосинтеза [63].
Методика эксперимента
Объектами исследования служили высечки d=2 см из листьев комнатных растений китайской розы (Hibiscus rosa sinensis СЗ растение), бобов (Vicia faba L.), а также хлоропласты, полученные из этих листьев. Растения были выращены в комнатных условиях 2.2.1.1. Выделение хлоропластов. В настоящей работе использовались хлоропласты двух видов растений: Vicia faba L. и Hibiscus rosa sinensis. Последовательность действий при выделении хлоропластов описана ниже. 1. Листья (15-г 30 г.) срезали непосредственно перед началом выделения (бобы) или 2-3 часа до него (шпинат, амарант), промывали в холодной воде. 2. Промытые листья помещали в гомогенизатор, заливали охлажденной средой измельчения и измельчали в течение 15-20 сек при скорости вращения лезвий 8000 об/мин. 3. Полученную смесь фильтровали через 8 слоев марли (с целью освобождения от фрагментов клеточной стенки и неразрушенных клеток) и затем подвергали центрифугированию. 4. Первое центрифугирование На этом этапе происходит отделение клеточного сока от суспензии хлоропластов. Время центрифугирования — 1.5 минуты при 2500g. Полученную суспензию заливали (при тщательном перемешивании) средой инкубации. 5. Второе центрифугирование. Цель последнего центрифугирования — осаждение хлоропластов. Раствор центрифугировали в течение 1.5-2 минут при 2500g. Полученный осадок ресуспендировали в небольшом количестве среды инкубации и на 30-60 минут помещался в пробирке с тающим льдом до проведения эксперименте. Среды, использовавшиеся для выделения хлоропластов, имели следующий состав: а) среда измельчения — 20 мМ Tris; 0.3 М NaCl; 2 мМ MgCl2; рН 8. б) среда инкубации — 5 мМ HEPES; 2 мМ КН2Р04; 2мМ MgCl2. Концентрация осмотика (сахарозы) составляла 50 или 500 мМ. Описанным способом выделяются хлоропласты класса Б, т.е. без внешней мембраны и не содержащие ферментов цикла Кальвина и локализованных в строме компонентов электрон-транспортной цепи или конечных акцепторов (ферредоксин, NADP ), но с неповреждённой тилакоидной мембраной, способные синтезировать АТР при освещении в присутствии искусственных акцепторов электронов [89]. Для каждого эксперимента хлоропласты в количестве 50 мкл помещались между двумя предметными стеклами d=2 см на держатель. Для приготовления растворов использовались следующие реактивы: Hepes, Tris, DCMU, КН2Р04, MgCl2 (6H20), NaCl, сахароза - марки ХЧ. 2.2Л.2.
Контроль состояния хлоропластов Для контроля состояния хлоропластов были проведены измерения окислительно-восстановительных превращений (ОВП) в электрон-транспортной цепи хлоропластов. В качестве метода регистрации ОВП был применен метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Запись спектров ЭПР осуществлялась при помощи спектрометра ЭПР Е-4 фирмы «Вариан». Все измерения проводили при комнатной температуре (20-22 С). В качестве источника света служил диапроектор «Этюд» с лампой накаливания мощностью 150 Вт, расположенный на расстоянии 40 см от собирающей линзы диаметром 15 см, с помощью которой свет фокусировался на образце. Для ослабления инфракрасной составляющей действующего света использовали тепловой фильтр (слой воды толщиной 5 см), расположенный в непосредственной близости от диапроектора. Для получения красного и дальнего красного света использовались интерференционные фильтры SIF-650 и SIF-707 соответственно ("Karl Zeiss Jena", ГДР), для ослабления света — фильтры нейтральные серые. Для измерения рН (теста на фосфорилирование) применялся рН метр Эксперт-001 "Эконикс-эксперт" Россия с комбинированным электродом для микрообъемов. Для приготовления растворов использовались следующие реактивы: Hepes, Tris, ADP, TEMPOamine ("Sigma"), DCMU, KH2P04, MgCl2 (6H2O), NaCl, метилвиологен (MV), NH4CI, сорбитол, сахароза - марки ХЧ. 2.2.1.2.1. Измерения фото индуцированных изменений величины сигнала ЭПР1. В данной работе измерения кинетики окислительно-восстановительных превращений реакционных центров ФС I (далее — кинетики ОВП Р7оо+) проводились следующим образом. 1. Из суспензии хлоропластов отбирали дозатором небольшой объем 50 мкл и разбавляли средой инкубации, так что полный объем полученной смеси составлял 95 мкл. 2. В эту смесь добавляли метилвиологен (MV) в количестве 5 мкл, так что его конечная концентрация в пробе составляла 7,5 мкМ. 3. Из пластиковой ячейки часть пробы (50-70 мкл) отбирали в стеклянную плоскую кювету, которую помещали в резонатор спектрометра ЭПР. 4. На спектрометре ЭПР устанавливались следующие параметры записи спектра. і. При измерении кинетики ОВП Руоо+ :мощность микроволнового излучения (Microwave Power) — 10 мВт; частота микроволнового излучения (Microwave Frequency) —9.17 ГГц; центр постоянного магнитного поля (Field Set) — 3258 Гс-3262 Гс; развертка сканирования поля (Scan Range) — off (отключена); усиление сигнала поглощения (Receiver Gain) — 2000; амплитуда модуляции постоянного магнитного поля — 4 Гс (параметр Modulation Amplitude = 8 Гс); частота модуляции постоянного магнитного поля (Modulation Frequency) —100 кГц; постоянная времени RC-фильтра (Time Constant) — 0.3 или 1.0 с; время сканирования (Scan Time) — 8 мин. ii. При записи спектра Р7оо+ (сигнала ЭПР 1):центр постоянного магнитного поля (Field Set) — 3260; развертка сканирования поля (Scan Range) — 100 Гс; постоянная времени RC-фильтра (Time Constant) — 0.1 или 0.3 с; время сканирования (Scan Time) — 4 мин.; остальные параметры — как в п.і). 5. Запись кинетики фотоиндуцированных изменений величины сигнала ЭПР I (кинетики ОВП Р7оо+ ) производили в следующей последовательности: і. записывали величину темнового сигнала (в течение нескольких секунд); ii. измеряемый образец (через окошко резонатора) освещали импульсом (длительностью 3 с) белого света. Смысл этой операции — предварительное восстановление всех реакционных центров ФСІ электронами, поступающими при световом импульсе от ФСII к Р7оо+» необходимое для стандартизации исходного состояния; iii. после выхода сигнала ЭПР I на стационарный уровень включали непрерывный дальний красный свет, получаемым с помощью интерференционного светофильтра SIF-707 фирмы "Karl Zeiss Yena" (максимум пропускания фильтра A.max = 709 нм, ширина полосы пропускания на полувысоте - АХщ = 13 нм). iv. после установления стационарной величины сигнала ( через 50-130 с после включения ДК света) светофильтр SIF-707 заменялся на другой интерференционный светофильтр SIF-650 (изготовитель — фирма "Karl Zeiss Yena", максимум пропускания фильтра max = 643 нм, ширина полосы пропускания на полувысоте - AA,i/2 =13 нм); Замечание. Смена режимов освещения (кроме вспышек) производились после выхода сигнала ЭПР I на стационарный уровень ( через 50-130 с после предыдущего переключения света); в дальнейшем при описании измерений об этом отдельно не упоминается, v. несколько раз переключали свет с А.650 на А.7о7 и белый, и обратно; vi. свет выключали, проводили аэрацию пробы и вновь производили переключения света vii. свет выключали и спустя 20-60 с образец освещали вспышкой белого света (длительностью 3 с). 7.
При записи спектра Руоо+ записывали обычно 2 спектра в следующем порядке: і. темновой спектр; ii. при освещении светом ДК; Обычно для записи всех спектров использовалась одна и та же проба хлоропластов. 2.2.1.2.2. Исследование кинетики фотоиндуцированных изменений сигнала ЭПР спиновой метки (ТЕМПОамина) В наших опытах по изучению протонного транспорта в хлоропластах мы измеряли фотоиндуцированные изменения сигнала ЭПР спиновой метки ТА согласно методике, описанной ранее [90]. При этом развертку сканирующего магнитного поля отключали, магнитное поле фиксировали на первом максимуме компоненты первой производной сигнала поглощения микроволновой мощности (Н=3244 +3245 Гс, Microwave Frequency v=9.17 ГГц, g=1.9993 ); амплитуда модуляции постоянного магнитного поля (Modulation Amplitude) устанавливалась равной 1.0 Гс, мощность микроволнового излучения (Microwave Power) — 10 мВт, коэффициент усиления (Receiver Gain) — 2000, постоянная времени RC-фильтра (Time Constant) —0.3 с, время сканирования (Scan Time) — 8 мин. Суспензию хлоропластов, содержащую 0.1 мМ ТА и 7.5 мкМ MV, освещали белым светом в течение 30 секунд, после чего свет выключали. 2.2.1.2.3. Изучение кинетики рН при фосфорилировании Для измерения рН при фосфорилировании использовалась проба следующего состава: 1 mM MgCb, 66 тМ сорбитол, 7 цМ метилвиологен, 1 mM КН2РО4, 0.4 тМ Na-ADP, рН 7.9 (максимум активности АТФ-синтетазы). В качестве контроля использовалась та же проба, но с разобщителем NH4CI (0,6тМ). Общий объем пробы составляет 700 мл. В пробу добавляли 50 мкл суспензии хлоропластов. Далее включали свет, среда защелачивалась, измерение изменения концентрации [Н ] проводили с помощью рН метра, свет выключали и проводили калибровку 50 цМ НС1.
Исследования температурных зависимостей параметров замедленной люминесценции
На рис. 7а схематически представлены действующие световые импульсы и регистрируемый сигнал замедленной люминесценции в зависимости от времени от начала включения световых импульсов. Необходимо отметить, что интенсивность действующего света и результирующего сигнала замедленной люминесценции на данном схематическом рисунке представлены не в соответствующих масштабах. Интенсивность замедленной люминесценции на несколько порядков меньше интенсивности действующего света. На рис. 8Ь представлена экспериментальная индукционная кривая замедленной люминесценции при температуре образца 37 С, серии подобных кривых являются непосредственными результатами наших опытов. Перед экспериментом обязательно измеряли величину «засвета» 1о и обязательно вычитали ее из всех последующих результатов, как паразитную. Для последующей интерпретации индукционных кривых использовались следующие параметры: Imax -максимальная интенсивность замедленной флюоресценции, h полуширина пика замедленной люминесценции, Imjn -стационарный уровень. Соответствующие зависимости от температуры представлены на рис.8,9,10. Максимальная интенсивность замедленной люминесценции имеет ненулевое значение в диапазоне температур от -23 до 50 С (рис.9). В диапазоне от 0 до 25 С имеет широкий максимум, интенсивность ЗЛ спадает по мере приближения к критическим температурам. На рис.8 изображен график зависимости полуширины индукционной кривой замедленной люминесценции от температуры. Минимальное значение полуширина принимает в диапазоне от 0 до 25 С, что кореллирует с минимальным временем индукции ЗЛ в физиологических диапазонах температур. При мере приближения к критическим температурам полуширина увеличивается, соответственно увеличивается и время индукционных процессов, что отражается на кривой замедленной люминесценции. На рис. 10 представлена температурная зависимость параметра (Imax-Imin)/Imax- На рис. 10 отчетливо виден широкий максимум в районе от 0 до 25 С, который спадает при температурах близких к критическим. На рис. 11 представлена температурная зависимость стационарной интенсивности замедленной люминесценции от температуры.
Данную зависимость можно, например, объяснить разной зависимостью от температуры скоростей прямых и обратных реакций. При температурах ниже -23 С происходят деструктивные изменения в реакционном центре и не идут даже прямые реакции. При повышении температуры начинают идти прямые реакции, но скорость обратных реакций больше чем прямых, после чего скорость прямых реакций все увеличивается и при физиологических значениях температур интенсивность замедленной люминесценции минимальна и в этом же диапазоне температур максимальна активность цикла Кальвина. Активность цикла Кальвина начинает снижаться, что вызывает увеличение скорости обратных реакций и соответственно интенсивности замедленной люминесценции. В конце концов в реакционном центре при 45-50 С начинают происходить деструктивные изменения, в результате которых интенсивность замедленной люминесценции падает вместе с падением скорости прямых и обратных реакций. По положениям этих пиков определяют холодостойкость и жаростойкость растения [6]. Наши результаты согласуются с исследованиями других авторов. В работе [92] исследовали температурные зависимости миллисекундной замедленной люминесценции зеленой и синезеленой водорослей, выращенных при 17 С и 26С . У первой группы при высокой интенсивности света (112 Вт на м ) при росте температуры от 5 С до 45С стационарное значение замедленной люминесценции сперва растет (при температурах от 5С до 10С), а затем постепенно уменьшается (с 10С до 45С). У второй группы стационарное значение замедленной люминесценции увеличивается с 5С до 10 С, затем с ростом температуры до 40С остается практически постоянным, а после 40С быстро уменьшается. При уменьшении интенсивности света температурная кривая стационарного значения замедленной люминесценции для выращенных при 17С водорослей имеет минимум при 25С, значения при 5С и 50С выше. Для группы водорослей, выращенных при температуре 26С, стационарное значение замедленной люминесценции сначала уменьшается, достигая минимума при 20С, затем растет до 45С, после чего снова уменьшается. Такое поведение стационарного значения напоминает часть описанной нами кривой в интервале температур от 5 С до 50 С. Исследования, схожие с проведенными авторами [92], описаны и в работе [93]; в этой работе измеряли зависимости стационарного значения замедленной люминесценции от температуры для водорослей, адаптированных к 17С и 26С. Зависимость для теплой культуры имеет два максимума, примерно при 10С и при 45С. Вид кривой напоминает описанный нами, но оба максимума сдвинуты к более высоким температурам, что, возможно, объясняется более низкой температурой выращивания. Для холодной культуры максимальное значение достигается при 10С, при более высоких или низких температурах происходит уменьшение стационарного значения замедленной люминесценции. В работе [93] объяснено увеличение замедленной люминесценции при высоких температурах. Оно связано с нарушениями донорной части ФС2, а дальнейший спад, наблюдаемый параллельно с увеличением начального значения люминесценции Fo - с необратимым разрушением комплекса ФС2.
С увеличением температуры наблюдалось уменьшение интенсивности миллисекундной замедленной люминесценции при температурах от 35С до 50С в работе [45]. Авторы считают, что происходит диссоциация белковой матрицы светособирающего хлорофилла из ФС2, уменьшая возбуждающую энергию, передающуюся на реакционный центр, а также тепловая денатурация мембранно-белковых компонентов. В нашей зависимости второй максимум находится в области 35С - 40 С, после него стационарное значение сильно уменьшается, согласуясь с данными авторов работы [45]. 3.2.1.2. Температурные зависимости стационарного значения замедленной люминесценции хлоропластов китайской розы и бобов На рис. 12 представлена температурная зависимость стационарной интенсивности замедленной люминесценции от температуры хлоропластов бобов, хлоропластов бобов с 10 цМ метилвиологена, хлоропластов китайской розы. Кривая температурной зависимости стационарной интенсивности замедленной люминесценции от температуры хлоропластов бобов представляет собой кривую с максимумом около 25 С. Кривая температурной зависимости стационарной интенсивности замедленной люминесценции от температуры хлоропластов бобов с 10 іМ метилвиологена представляет собой двухвершинную кривую с максимумами около 12 и 30 С. Если проводить аналогию с подобными кривыми, полученными на листьях растений, можно сделать вывод, что диапазон нормального функционирования хлоропластов уменьшился по сравнению с подобным диапазоном у листьев. Следовательно, при выделении хлоропластов также были удалены вещества, позволяющие растению легче переносить температурный стресс. Выделение хлоропластов из листьев китайской розы следует признать неудачным, ни один из тестов не дает фотосинтетической активности сравнимой с хлоропластами бобов. Поскольку зависимости стационарного значения ЗЛ на листьях бобов и листьях китайской розы следует признать схожими, можно предположить, что данная зависимость универсальна для всех Сз растений и для каждого опыта выбирать наиболее подходящие и доступные растения. 3.2.1.3. Температурные зависимости стационарного значения замедленной люминесценции листьев китайской розы, влияние ингибиторов На рис. 13 представлена влияние ингибиторов электронного транспорта на температурную зависимость стационарного значения ЗЛ. Изучалось влияние ингибитора электронного транспорта DCMU блокирующий ЭТЦ между хинонами QA и QB, а также ингибитора DMIB разрывающего ЭТЦ после QB, эксперименты проводились на листьях китайской розы. Можно отметить влияние ингибитора DCMU температурную зависимость стационарного значения ЗЛ.
