Введение к работе
Актуальность темы. Исполнительный аппарат поперечно-полосатой мышцы уже более полувека является предметом интенсивных исследований. Основной результат этих исследований - создание модели сокращения, так называемой модели скользящих нитей (H.Huxley, Hanson, 1954; A.Huxley, Niedergerke , 1954) и мостиковоЯ модели генерации силы (H.Huxley, 1969; A.Huxley, Simmons, I9?I). Несмотря на огромный прогресс в познании структурных основ мышечного сокращения многие вопросы остаются до сих пор открытыми, что существенно., затрудняет выяснение молекулярных механизмов генерации силы мышцей, его регуляции и энергообеспечения.Поэтому изучение структуры сократительного аппарата мышцы продолжает оставаться одним из актуальных направлений проблемы мышечного сокращения. Структура толстых, или миозин-содержащих и тонких, или актин-со-держащих нитей, взаимодействие которых лежит в основе мышечного сокращения, является предметом наиболее интенсивных исследований.
Электронная микроскопия является эффективным методом исследования структуры, хотя имеет дело с фиксированным тем или иным способом препаратом. В отличие от электронной микроскопии метод дифракции рентгеновских лучей обеспечивает возможность исследования живого объекта. Однако интерпретация данных, полученных этим методом, часто затруднена или невозможна из-за многокомпонентнос-ти" сократительных нитей и тем более мышечных саркомеров. В этих случаях использование метода электронной микроскопии в совокупности с оптической дифракцией позволяет пллучать информацию о структуре отдельных участков нитей и понять происхождение рефлексов, наблюдаемых на рентгенограммах, а в ряде случаев и причины их изменений при сокращении мышцы. Безусловно, что плодотворность метода электронной микроскопии базируется на отлаженное методов препаративной биохимии, позволяющих сохранять нативную структуру объекта в процессе его приготовления. Во многом сохранению реальной структуры способствует использование таких перспективных методов подготовки мышечных объектов для электронной микроскопии, как замораживание-высушивание, замораживание-травление-скалывание, замораживание-замещение и т.п.
Цель работы. Настоящая работа посвящена изучению структуры сократительных нитей поперечно-полосатых мышц позвоночных и их отдельных белков методами электронной микроскопии и оптической дифракции с использованием для подготовки объекта негативного контрастирования, кругового напыления, срезов, реплик и криометодик.
В работе решались следующие конкретные задачи: I. Изучить внутреннюю организацию толстых нитей скелетных мышц:
упаковку легкого меромиозина (ЛММ) внутри нити и наличие в ней стержневой структуры.
-
Определить периоды локализации минорных белков в разных зонах вдоль толстой нити скелетных и сердечных мышц.
-
Изучить характер структурных изменений в толстых нитях при переходе скелетной мышцы из состояния покоя в состояния ритора и контрактуры.
-
Изучить связывание F-белка (фосфофруктокиназы) с актин- и миозин-содержащими нитями скелетных мышц.
-
Изучить связывание альдолази с актин-содержащими нитями в составе 1-дисков скелетных мышц.
Научная новизна работы. В работе получен ряд новых данных о структурно-функциональных свойствах сократительных нитей поперечно-полосатых мышц. Обнаружена полая.стержневая структура внутри толстых нитей скелетных мышц. Определена упаковка молекул вдоль паракристаллических нитей ЛММ, основного белка ствола толстых нитей. Разработан метод получения изолированных миофибрилл из сердечных"мышц кролика, обеспечивающий сохранность структуры А-диска. Использование этого метода позволило впервые сохранить и выявить электронно-микроскопически весь набор полос минорных белков в А-дисках миофибрилл сердечных мышц.Установлено, что периоды локализации минорных белков в разных участках вдоль толстых нитей как скелетных, так и сердечных мышц отличаются на 1-2нм. Этот факт был объяснен небольшими различиями в периодах упаковки ЛММ--частей миозина в стволе нити. Показано, что осевые координаты основных "миозиновых" меридиональных рефлексов на картинах оптической дифракции от разных зон А-дисков скелетных мышц практически не меняются при переходе мышцы из состояния покоя в состояния ритора и контрактуры. Это свидетельствует об отсутствии значительных изменений в структуре стволов толстых нитей при изменении состояния мышцы. Обнаружено Са^-зависимое связывание фермента гликолиза альдолази с тонкими нитями в составе изолированных 1-дисков. Выявлена способность фосфофруктокиназы связывать^ in vitro с миозиновыми и актиновыми нитями. Определена ее локализация в А-диске скелетной мышцы"кролика.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о структуре и функциональной роли сократительных нитей поперечно-полосатых мышц и стимулируют дальнейшие исследования в этом направлении.
Разработанный метод получения миофибрилл из сердечных мышц кролика, обеспечивающий сохранность их структуры, открывает возможности для дальнейших структурно-функциональных исследований 2
сократительных нитей разных мышц в норме и патологии.
Новые данные о структуре толстых нитей помогли объяснить природу ряда меридиональных рефлексов на рентгенограммах скелетных мышц и были успешно использованы в теоретических расчетах картин рентгеновской дифракции при построении моделей толстых нитей.
Полученные данные об обратимом Са+-зависимом связывании ферментов гликолиза с сократительными нитями важны для понимания механизма регуляциигликолиза, для диагностики и лечения некоторых энзимогатий.
Апробация работа. Основные результаты были доложены на Всесоюзных симпозиумах да биофизике и биохимии мышц (Тбилиси, 1974; 1983; 1987); П-ом Международном .симпозиуме "Механизмы мышечного сокращения" (Румыния, Бухарест, 1989); Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989); Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); Всесоюзных симпозиумах "Криогенные методы в электронной микроскопии" (Пущино, 1975, 1990); Международном симпозиуме по замораживанию-скалыванию (ГДР, Йена, 1979); Всесоюзных конференциях по электронной микроскопии (Петрозаводск, 1976; Сумы, 1982; Москва, 1988).
По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (НО наименований). Работа изложена на-108 стр., включает 34- рис. и 3 таблицы.