Введение к работе
Актуальность работы
Ишемия является одной из причин нарушения функции сердца (ВоШ, 1982). Ранняя стадия ишемии характеризуется нарастающей гипоксией, с которой связывают обратимые изменениями физиологии мышечной клетки, прежде всего дисбаланс ионов на мембране кардиомиоцита (Allen, Orchard, 1987; Silverman, Stern, 1994; Pierce, Czubryt, 1995). Уже в начале ишемических условий регистрируется выход калия из мышечной ткани (Kleber, 1984). Предполагается, что наблюдаемое увеличение концентрации калия в плазме крови определяется перераспределением катиона К+ из миоцита во внеклеточное пространство и . является реакцией клетки на замедление доставки кислорода (Benndorf et al., 1991; Lindinger, 1995). Индуцированный ишемией внутриклеточный дефицит калия сопровождается накоплением в цитоплазме кардиомиоцита натрия, что провоцирует вход в клетку экзогенного кальция. Именно кальциевая перегрузка цитозоля вызывает необратимую потерю сократительной функции сердца (Steenbergen et al., 1990; Du Toit, Opie, 1992). По-видимому, механизмы регуляции ионного баланса кардиомиоцита, специфичные для ранней ишемии, лежат в основе ряда явлений, которые изучаются фундаментальной кардиологией. К ним можно отнести: гибернацию, как состояние ткани сердца в условиях гипоксии (Heusch, Schulz, 1996); явление, обозначенное термином "preconditioning", которое заключается в защитном эффекте кратковременной ишемии/реперфузии для последующей длительной ишемии (Zellner et al., 1996); феномен долговременной потери сердцем сократительной функции после кратковременной ишемии — "stunning" (Shen, Vatner, 1995), а также запуск механизмов апоптоза и некроза миоцита (Skulachev, 1998; Crompton, 1999; Bernardi et al., 1999; Halestrap et al., 2000; Loeffler, Kroemer, 2000).
Постоянный интерес к проблеме регуляции баланса калия, натрия и хлора в мышечной клетке сердца при ишемии объясняется возможностью использования результатов экспериментальных исследований в клинической практике. Например, один из способов коррекции ранней ишемии основан на предупреждении накопления натрия в клетке (Murphy et al., 1991; Scholtz ct al., 1992; Fliegel, Fruhlih, 1993; Karmazyn et al., 1993; Pike et al., 1993). С другой стороны, требуют своего исследования механизмы, лежащие в основе подходов, широко и успешно используемых в клинике, например, применение тройной смеси калия, инсулина и глюкозы при ранней ишемии (Laborit, 19650). Представляет интерес также тестирование на модельных системах фармакологических препаратов (Cheung et al., 1983; Liu et al., 1993; Tosaki et al., 1993, VanEmous et al., 1997; Goodwin et al., 1998) и действия различных условий (Lopez et al., 1996), корректирующих ищемию.
С начала 80-х годов накоплен большой объем данных, полученных на сердце, препаратах ткани сердца и первичной культуре кардиомиоцитов, которые косвенно подтверждают наличие последовательных изменений состава элементов в мышечной клетке сердца на стадии ранней ишемии. Показано, чго ионный баланс кардиомиоцита регулируется прежде всего механизмами на мембране клетки, которыеактивируются в условиях недостатка кислорода и нарушения транспорта метаболитов, среди них: АТФ зависимый (Кдхф) и натрий зависимый (Кма) калиевые каналы, Na+-H+ обмен, транспорт лактата из кардиомиоцита
(Noma 1983; Kameyama et al., 1984; Lazdunsky et al., 1985; Gaspardone et al., 1986). Многочисленные экспериментальные работы посвящены исследованию метаболических и морфологических нарушений в миоците при ишемии (Jennings, Reimer, 1981; Reimer et al., 1983; Piper et al, 1984, Allen, Orchard,1987; Ely, Berne, 1992; Kaul et al., 1993; Tanonaka et al., 1996). Однако, до сих пор остается неясной последовательность событий, вызывающих изменение содержания элементов в клетке в ответ на ишемические условия. По-прежнему, не имеет прямого подтверждения наличие калиевого дефицита в кардиомиоците и накопление в цитоплазме натрия, не ясен способ перераспределения калия из клетки в просвет капилляра, не исследовано, значение транспорта лактата и хлора в регуляции ионного баланса кардиомиоцита, нет полной картины взаимосвязи ионных и метаболических изменений в миоците в течение ишемии. Следует особо отметить проблему роли эндотелия капилляра в реакции сердечной ткани на условия ишемии, т.к. эндотелиальная клетка является не просто морфологическим барьером, но осуществляет активную функцию в формировании ионого гомеостаза кардиомиоцита.
Последние двадцать лет во многих лабораториях проводились исследования, цель которых была получить ответ на поставленные вопросы. Однако, полученные данные носили косвенный характер, причиной чего было отсутствие адекватных методов анализа элементного состава одиночной клетки в ткани. Анализ проводили on mass на изолированном сердце (ЯМР спектроскопия, изотопный анализ) и препаратах ткани сердца (пламенная фотометрия, атомно-адсорбционный анализ, калий селективные электроды) или на мембране изолированного кардиомиоцита. Развитие электронно-зондового микроанализа и криогенных методов подготовки ткани в сочетании с экспериментальными технологиями, моделирующими условия(близкие к интактному состоянию, дает подход к решению сформулированных выше проблем.
Цель и основные задачи
В связи с изложенным( целью настоящей работы было разработать технологию, позволяющую применить электронно-зондовый микроанализ в эксперименте, моделирующем условия ранней ишемии. Затем, используя созданную экспериментальную базу, исследовать динамику изменения ионного баланса и последовательность активации специфичных мембранных механизмов в мышечной клетке сердца на биологических системах разного уровня организации. При выполнении работы решалось несколько задач:
Изучить связь изменения внутриклеточного элементного состава и ультраструктуры мышечной клетки сердца в условиях целостного организма при функциональной ишемии, вызванной действием на животное длительной гипертермии.
Исследовать изменение элементного состава мышечной клетки сердца при гибернацин теплокровного животного - эволюционно обусловленном физиологическом состоянии в условиях гипотермической ишемии суслика (Citellus undulatus).
Анализ изменения элементного состава (К, Na, СІ) в мышечной клетке изолированного сердца, вызванного длительной нормоксической перфузией, полной ишемией и аноксической перфузией.
Оценить влияние ингибиторов Na/K-АТФазы на внутриклеточную концентрацию элементов (К, Na, СІ) при аноксической перфузии. Исследовать действие кратковременной реперфузии на элементный состав (К, Na, СІ) мышечной клетки изолированного сердца после ишемии различной длительности.
Изучить возможность использования первичной культуры кардиомиоцитов для изучения in vitro действия ишемии на внутриклеточный элементный состав ( К, Na, СІ). Научная новизна работы
Получены прямые данные, подтверждающие наличие дефицита калия и накопление натрия в мышечной клетке сердца крысы при ранней ишемии. Получены свидетельства участия эндотелиальной клетки капилляра в формировании гомеостаза кардиомиоцита.
Показано накопление, калия в мышечной клетке сердца суслика (Citellus undulatus) при гибернаиии.
Установлено, что длительная нормоксическая проточная перфузия физиологическим раствором, насыщенным кислородом, приводит к характерному для гипоксии изменению состава ионов (К, Na, СІ) в миоците изолированного сердца.
Показано, что гипотермия (10С) при перфузии предотвращает гипоксические изменения содержания элементов (К, Na, СІ) в миоците изолированного сердца. Определена временная зависимость изменений концентрации элементов (К, Na, СІ) в миоците изолированного сердца при полной ишемии. Показано наличие активного транспорта калия на этапе ранней ишемии. В условиях аноксической перфузии изолированного сердца показано, что ишемия создает условия, которые предполагают функциональную взаимосвязь в работе Na/K-АТФазы и Кдтф канала.
Раскрыт механизм опосредованного действия ингибиторов Na/K-АТФазы на состояние кардиомиоцита. Согласно развиваемым в работе представлениям о роли взаимодействия эндотелиальной и мышечной клетки, первичной мишенью действия ингибиторов является Na/K-АТФаза эндотелиоцита. На первичной культуре ткани сердца показано, что кардиомиоциты в культуре представляет из себя клеточные образования — микросинцитии. Среди них наибольшей интактностью обладают те образования, в которых сохраняются межклеточные контакты. Научно-практическая ценность
Создана технология анализа содержания элементов в цитоплазме мышечной клетки, которая включает перфузию изолированного сердца, криотомию свежевыделенной папиллярной мышцЫсердца и электронно-зондовый микроанализ элементного состава миоцита на криосрезе. Данная технология позволяет тестировать различные физиологически активные соединения, химические агенты и способы
воздействия на клетку изолированногосердца по критерию изменения внутриклеточного элементного состава.
Разработан эффективный метод быстрого снижения концентрации кислорода (<3% от нормоксической перфузии) в перфузирующем растворе путем
предварительной вакуумной дегазации раствора, что позволило создать условия аноксической перфузии сердца. => Установлено, что гипотермическая перфузия изолированного сердца, которая проводилась при 10 С, вызывает консервацию элементного состава кардиомиоцита. Данный факт имеет значение для разработки новых способов трансплантации, консервации органов или реконструирующей хирургии. => Показано, что кратковременная перфузия раствором строфантидина (0.1 мМ) стимулирует Na/K-АТФазу мышечной клетки изолированного сердца в условиях аноксии. Для получения прямого эффекта ингибирования Na/K-АТФазы при перфузии следует использовать более высокую концентрацию гликозида или увеличивать время его действия. => Показано, что реперфузия приводила к накоплению натрия в мышечной клетке изолированного сердца только в середине периода ишемии. Таким образом, повреждающий эффект реперфузии обусловлен не столько длительностью ишемии, но ее стадией (состоянием миоцита), что необходимо учитывать в практике консервации и реперфузии сердца. =s> Показано, что первичная культура миоцитов ткани сердца гетерогенна. По критерию внутриклеточного содержания калия и натрия не более 25% кардиомиоцитов в культуре сохраняют интактное содержание элементов в клетке, что следует учитывать при разработке эксперимента на первичной культуре ткани сердца.
Апробация работы. Фрагменты работы доложены и обсуждены на международных конференциях: 12 ICXOM (Cracow, 1989), "Low temperature microscopy and microanalysis" (Cambridge, 1990), 12th Pfefferkorn Conference "The Science of Biological Microanalysis" (Cambridge, 1993),"MICRO 96" (London, 1996), "CRYO 97" (York, 1997), "Scanning 97" (California, 1997), "Biological Motility: modern methods for studying" (Pushchino, 1998), "Heart disease-new trends in research, diagnosis and treatment" (Washington, 1999), "Electron probe microanalysis today-practical aspects" (Trest, 2000), а так же на Всероссийских конференциях: "Криогенные методы в электронной микроскопии" (Пущино, 1985),"Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц" (Пущино, 1996), "Гипоксия: механизмы, адаптация и коррекция" (Москва, 1997), "Профилактическая кардиология" (Москва, 2000), "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино, 2000) и на заседании Физиологического клуба ВКНЦ (2000, г.Москва)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 51 печатная работа, из них 25 статей (16 в зарубежных изданиях) и 26 тезисов докладов (15 в материалах международных конференций).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, объектов и протоколов эксперимента, изложения полученных результатов, их обсуждения и комментариев, выводов, заключения и списка цитируемой литературы.