Введение к работе
;- , ,.
Актуальность темы.
Понимание молекулярных основ функционирования живой клетки — одна из наиболее актуальных задач современной науки. Главным направлением развития рассматриваемой проблемы является объяснение сложного и разнообразного поведения биополимеров, которые служат строительными и функциональными блоками клетки. Особенность биополпмерных макромолекул состоит в том, что они в условиях притока энергии и питательных веществ, поддерживаемых в клетке, ведут себя как своеобразные автоматические механизмы, выполняющие конкретные биологические функции.
Макромолекулы белков и фрагменты ДНК могут изучаться теоретически с помощью компьютерного моделирования методами молекулярной динамики, основанными на численном решении уравнений Ньютона. Хотя этот подход является наиболее непосредственным и детальным, он оказывается недостаточно эффектпвным для решения задач о конформацпях макромолекул биополимеров на больших пространственных и временных масштабах ввиду огромных вычислительных затрат п необходимости работы с фемтосекунднымп элементарными шагами по времени. Другой важный подход основан на методе Монте Карло, который применим к произвольным термодинамическим системам, и, как правило, позволяет достаточно эффектпв-
но изучать структурные свойства системы. Центральными недостатками метода являются его привязанность к конкретному механизму движений, трудность доказательства эргодичности, медленная сходимость к состоянию равновесия, в особенности для фрустрпрован-ных систем с конкурирующими взаимодействиями, а также необходимость большого числа статистически независимых измерений для надежного получения усредненных характеристик.
По этой причине важно развивать более огрубленные методы описания системы, в которых биополимеры рассматриваются как некоторые специальные виды полимеров с точки зрения общей природы взаимодействий протяженных макромолекул. Многие черты поведения биополимеров в сильно разбавленном растворе отражают универсальные свойства таких объектов, и лишь некоторые из них связаны с конкретикой потенциалов взаимодействия. Поэтому, выявление универсальных законов полимерных систем, обладающих неоднородно-стями вдоль цепи, служит необходимой предпосылкой для продвижения в понимании функционирования биополимеров.
Изучение данного класса задач может проводится в рамках методов статистической физики макромолекул. В статистической физике оперируют не индивидуальными конформацпями отдельной макромолекулы, а статистическим ансамблем всех возможных конфор-мацпй данного класса макромолекул с характерными параметрами взаимодействия и химической композиции при заданных термодинамических условиях (температура, концентрация, внешние возмущения и т.д.). Таким образом, система описывается статистическими средними наблюдаемых, параметрами порядка, позволяющими отлн-
чпть различные фазовые состояния, и функциями отклика на внесение внешнего возмущения. Вся схема может быть обобщена на зависящие от времени кинетические процессы.
Кинетика изучает неравновесные свойства систем, следующие за таким мгновенным изменением термодинамических параметров, которое переводит данную систему в другую равновесную фазу. Кинетика имеет важнейшие приложения в химической физике для изучения скорости химических реакций макромолекул, а также для контроля технологических процессов происходящих с изменением температуры и концентраций различных реагентов.
Неравновесные свойства макромолекул особенно актуальны в биофизике. Процессы разрезания двойной спирали ДНК топопзомеразоп с последующим конформащюнным преобразованием, которое предшествует репликации ДНК, а также процесс самоорганпзацпп белка с помощью шаперонов в натпвное состояние после его синтеза в рибосоме, могут служить конкретными примерами важнейших кинетических бпопроцессов. Непрерывное и согласованное осуществление кинетических процессов в клетках лежит в основе фундаментальной загадки функционирования живых организмов.
Равновесные свойства полимеров в сильно разбавленных растворах на протяжении многих лет были предметом серьезного изучения в рамках методов статистической физики и скейлпнговых теорий. Сюда входит описание различных конформацпонных изменений макромолекул, сопровождающих переходы клубок-глобула, спираль-клубок, а также преобразования плотных глобулярных состояний, такие как мпкро-фазное расслоение, кристаллизация, ренатурацпя бел-
ков и полппептпдов, формирование тороидальных и других сложных структур ДНК п синтетических олигонуклеотпдов.
По ряду прпчпн теоретический прогресс в понимании кинетики конформационных переходов полимеров был достаточно ограниченным. Среди немногих теоретических работ по кинетике перехода клубок-глобула для гибкого гомополимера следует отметить "сосисочную" модель де Жена, а также работы Ю.А. Гросберга и Д.В. Кузнецова по модели "скомканной" глобулы. В определенной мере оценки в этпх работах носили качественный характер, что оставляет желанным развитие более систематической теории, которая также может быть применена к сложным биополимерам.
В диссертации развивается аналитический метод гауссова самосогласованного поля, основная идея которого заключается в замене точного нелинейного уравнения Ланжевена "наилучшим" линейным уравнением с неизвестными зависящими от времени параметрами, которые определяются самосогласованно. Кинетические уравнения, выводимые в гауссовом методе для простейшего случая гомополимера, допускают достаточно наглядную интерпретацию кинетики системы как движения в фазовом пространстве динамических переменных, представляющих поток всего статистического ансамбля, против градиента свободной энергии, т. е. в направлении ее максимального падения.
Применение метода к случайным сополимерам позволяет изучить наиболее универсальные черты структуры состояний и кинетики процесса самоорганизации глобулярных белков. Как известно, определенность третичной структуры белка в натпвном, состоянии обес-
печпвает его функциональные свойства в бпопроцессах. Проблему объяснения правил, по которым линейная последовательность аминокислот определяет третичную структуру белка, называют "второй половиной генетического кода". Решение этой проблемы имеет огромное бпо-технологическое значение для дизайна и синтеза белков с необходимыми свойствами.
Анализ жесткой макромолекулы служит предпосылкой к детальному пониманию крупномасштабной структуры конформацпй двойной спирали ДНК. Длина молекул ДНК может достигать 109 пар оснований, тем не менее, внутри клетки ДНК существует в виде чрезвычайно сложной глобулярной структуры с линейным размером всего порядка ЮОнм. Эта структура имеет много иерархических уровней организации и совместно с определенным количеством специальных белков образует хроматпновый комплекс. Одиночная молекула длинной двойной сппрали ДНК, благодаря ее высокой жесткости, помещенная в плохой растворитель, молекулы которого не притягиваются к сильно заряженным фрагментам ДНК, может принимать тороидальную глобулярную конформацию.
Эти и некоторые другие конкретные приложения разрабатываемого в диссертации подхода к изучению кинетики конформацпонных преобразований синтетических п бпо-макромолекул определяют актуальность темы диссертации.
Цель диссертационной работы — развитие адекватных методов неравновесной статистической фпзпкп, применимых к произвольным гетерополпмерам в разбавленных растворах, а также их приложение к изучению состояния равновесия и кинетики конфор-
мацпонных преобразований статистических моделей, которые могут служить прототипами для описания наиболее универсальных конфор-мационных свойств биополимеров, включая самоорганизацию белков за счет гидрофобного эффекта, и мотив жесткости в определении кон-формацпонной структуры, глобулярной ДНК.
Научные результаты и новизна работы.
-
Построен метод гауссового самосогласованного поля для описания кинетики п состояния равновесия произвольных полимерных цепей в сильно разбавленных растворах. В качестве базовой использована модель, основанная на эффективном функционале свободной энергии Эдвардса, который получается с помощью процедуры "огрубления" молекулярного гамильтониана взаимодействия с последующим эффективным устранением степеней свободы растворителя. Детальное изучение проведено для функционала, содержащего члены взаимодействия отвечающие за связность н жесткость цепи, а также эффекты исключенного объема с произвольной зависимостью эффективных впрпальных коэффициентов от положения вдоль цепи.
-
Исходя из феноменологического уравнения Ланжевена, в данном приближении получены самосогласованные кинетические уравнения для одновременных корреляционных функций координат мономеров. Показано, что стационарный предел самосогласованных кинетических, уравнений совпадает с уравнениями вариационного принципа Н.Н. Боголюбова.
-
Вычислены коэффициенты эффективного потенциала и эффективное трение гомополимера. Показано, что кинетические самосогласованные уравнения в этом случае могут быть переписаны как урав-
ненпя движения против градиента "мгновенной" свободной энергии в фазовом пространстве усредненных нормальных мод системы.
-
Стационарный предел кинетических уравнений для гибкого го-мополпмера аналитически проанализирован с помощью метода доминантного баланса.
-
Проведено детальное численное п аналитическое изучение кинетики неравновесного перехода клубок-глобула для гибкого гомополп-мера. Это позволило выявить наличие ряда различных кинетических стадий, описываемых характерными законами.
-
Обнаружен механизм сппнодального разложения во внутренней метрике цепи, определяющий протекание начальной кинетической стадии. Получены спектр экспоненты Ляпунова, содержащий интервал нестабильных .мод, а также коэффициенты разложения отклонения амплитуд нормальных мод. что дало возможность вывести закон степенного падения радиуса инерции при малых временах.
-
Найдено, что характерное время стадии огрубления зависит от длины цепи, Лт, как Л'2 (.V3^2) при отсутствии (наличии) гидродинамического взаимодействия. Получены скейлпнговые законы для времен окончательной релаксации и "полного" сворачивания в зависимости от длины цепи и впрпальных коэффициентов. Проанализировано поведение амплитуд нормальных мод п гидродинамического радиуса на протяжении всего кинетического процесса.
8. Изучена фазовая диаграмма жесткого.гомополпмера, которая,
наряду с клубковым и глобулярным состояниями, содержит состояние
тороидальной глобулы. Изучение устойчивости тороидальной кон-
формашш показало, что тор термодинамически стабилен лишь прп
достаточно высокой жесткости в ограниченном интервале второго ви-рпального коэффициента и длины цепи. Обнаружено, что переходы клубок-тор и тор-сферическая глобула являются переходами первого рода, обладающими верхней и нижней сшшодальнымп линиями. Данные переходы стыкуются друг с другом и линией непрерывного перехода клубок-сферическая глобула в "трнкрнтической" точке, положение ко jpon определено теоретически.
9. Детально изучена кинетика конформащгонных переходов
клубок-сферическая глобула, клубок-тор, тор-сферическая глобула,
а также процессы разворачивания в клубок. Кинетические зако
ны объяснены в терминах полной топографической карты свободной
энергии. Проанализированы скейлннгп характерных времен преобра
зований в зависимости от длины полимера и жесткости. Получены
законы для времен замедления кинетики при приближении к сппно-
дальным лпнпям, которые оказываются степенными с некоторыми
универсальными показателями.
-
Результаты пунктов 8 и 9 дают теоретическое объяснение ряду экспериментальных данных о конформацнонных свойствах ДНК на больших масштабах, которые во многом определяются ее значительной жесткостью.
-
Метод гауссового самосогласованного поля применен к периодическим блочным сополимерам. Данные уравнения численно проинтегрированы для простейшего сополимера, блок которого состоит из двух мономеров различных типов. Показано, что в отличие от го-мополпмера, переход клубок-глобула для него характеризуется резким ппком теплоемкости. Обнаружено, что переход клубок-глобула
этой системы сопровождается расслоением фаз, ведущим к структуре глобулы с преимущественно гидрофобным ядром п гидрофильной оболочкой.
12. Основным достижением диссертационной работы является
развитие метода гауссового самосогласованного поля для случайно
го фрустрированного взаимодействия с фиксированным распределе
нием беспорядка. Предложенный подход является альтернативным
применению формализма реплик теории спиновых стекол, и обла
дает тем преимуществом, что он применим не только к.состоянию
равновесия, но и к кинетике. Метод применен к случайному амфп-
фнльному сополимеру, свойство гидрофобностп мономеров которого
является гауссовой случайной величиной с заданным распределени
ем. Выведен набор кинетических самосогласованных уравнений для
корреляционных функций нормальных мод и переменных беспорядка,
характеризуемых произвольной матрицей дисперсий.
13. Получена диаграмма состояний данной системы при констант
ной матрице дпсперспй случайных переменных. Фазовая диаграмма
содержит нормальную (типа гомополпмерной) и "случайную" (с за
мороженной петлеобразной структурой) клубковые фазы, и три раз
личных глобулярных состояния: жидкая глобула (аналогичная гомо
полпмерной), замороженная и упакованная глобулы.
14. Изучена кинетика сворачивания клубка в замороженную и
упакованную глобулы. В последнем случае имеет место несколько
кинетических стадий, различаемых поведением основных параметров
порядка. Наиболее интересным является сильное замедление кинети
ки за счет наличия промежуточного замораживания.
15. Результаты анализа позволяют надеяться, что полученная фазовая диаграмма и качественное поведение характерных наблюдаемых в кинетике дают естественную интерпретацию экспериментально известным свойствам натпвной третичной структуры и кинетике процесса самоорганпзацпп ряда глобулярных белков, для которых важнейшим фактором стабильности является гидрофобно-гидрофильные взаимодействия аминокислотных остатков.
Практическая ценность работы. Практическая ценность полученных результатов определяется широким применением статистической теории макромолекул в молекулярной биофизике. Понимание структуры состояний и кинетики конформацпонных преобразований белков и нуклеиновых кислот имеет чрезвычайно важное фундаментальное п бпо-технологическое значение. Предложенный подход оказывается достаточно гибким, что позволяет применять его к сложным полимерным системам. Его использование привело к конкретным предсказаниям о тороидальной конформацни ДНК и процессе самоорганпзацпп глобулярных белков, подтверждаемых рядом экспериментальных данных. Данный аналитический метод неравновесной статистической фпзпкп является общим п может быть использован практически для любого эффективного функционала свободной энергии. Это позволяет ожидать, что дальнейшее улучшение метода путем учета более реалистического распределения вероятностей, а также его приложения к другим макромолекулярным структурам, окажется плодотворным и приведет к выявлению аналитических законов кинетики этих систем.
Апробация работы. Результаты диссертации опубликованы в работах [1-8] и докладывались на ряде международных конференций, включая конференцию " Наноструктуры п самоорганизация полимерных систем" (ст.-Петербург-Москва, 18-2G мая 1995 г.). а также на Путинской городской конференции молодых ученых (15-17 мая 199G г.) и межлабораторных семинарах ИТЭБ РАН (г. Пущпно) п UCD (Дублин, Ирландия).
Структура диссертации. Диссертация состоит из 8 глав п 5 приложений, содержит 14 таблиц и 45 рисунков, а также список литературы (131 названия). Объем диссертации 165 страниц.