Введение к работе
ЛКТХЗЛЬЯС^ЯЬ_ТЄМЦ. СОГЛЗСИО ТСОрИП ?ЙГТЧЄЛЗ (Hltcbel,1966), сопряжение электронного транспорта с састсмсЯ синтеза АТФ в мжгохокдршіх, хлоропластах и бактериях осуществляется за счот рпсогн двух типов протонных помп, которые осуществляют трансмембранний порепос ноноп водорода. Это tsk иазмаэе».яе дыхательные помпы и А7Р-с;гятазв. Аль-тернзтігвизя теория Внльямсн также предполагает, что а сспряячгос! участвуют ионы водороде. Однако, согласно этой гипотезе перекос протонов, обладаниях избытком свободной энергии, от длительной аегга к АТФ-синтазе осуществляется непосредственно внутри или по поверхности мембраны. Такой механизм предполагает существование высокого кинетического барьера, препятствупиего быстрому переносу конов водорода с поверхности мембпаны в Боднув фазу.
Ключевым в этой связи является определение лкмятирупаеЯ стадна процесса переноса протонов через мембрану. Если скорость трансмембранного перенос иоесв водорода ограничена транспортом прогона теге» гидрофобный слой мембраны, то КЕВвтаческип барьер для переноса ясное водорода в интерфазе мембрзна/водз по значительный по сравнении с кинетическим барьером самой мембраны. При этом устанавливается равновесие между ионами- водорода, находящийся на границе раздела мембрана/вода и в объеме буферного раствора.
Если хинетичестшй барьер для переноса ионов водорода через мож-фазную границу большой, транспорт протонов штат быть' ограничен скоростями гетерогенных реакции'отрыва-присоединения ионов БОДОрОДЭ на поверхности мембраны. В таком случае при трансмембрзнном переносе протонов образуется пул связанных с поверхностью мембрана ионов водорода, обладащих избытком свободной энергии.
На протянении многих лет вопрос о судоптвоваяаи "мембранного пуло
ІТрОТОНОЗ** ШЩЮКр ООсуаДОетсЯ В ЛИТерзТУрО (De KouchkovHky,1935;
Dilley,l989i. в последам? время появляются экспериментальные работа. свидетелъстБувдих о том, что в опроделеюшх условиях лиміпирущей стадией в проішесах транспорта ионов водорода через мембрану явдяжт-ся ре.акцяи протонирования-дощютонпроваштя функциональных груш
ИОНОфоров (Riddel,1908; Decker,1988) ИЛИ фарМвНТОВ (Drachev,1984;
Silverman, 1969; Denchcr, 199.1)на границе раздела фаз мембрана/вода .
_Шї1і'__настоящей__взйотн - на модельной ОкслоШюГ: лндидной меадирз-ке получить экспериментальные данные,подтворадовдив возможность локального сопряжения процессов электронного транспорта и фосфорили-рорания. протекающих в меморанах китохондрга к хлоропластов. В этой связи мы попытались продемонстрировать возм.'эд.остъ образования пула связанных с поверхностью мембраны ионов водорода, обладавших избыт-ком сбооодной энергии в условиях стационарного потока протонов через бнелопную липидную мембрану.
Ставились слодутаие основное задачи: найти условия, в которых лимитирующей стадией катион/протонкого обмена являэтея реакции протонированпя-депротошфовония иопофоров на поверхности раздела фаз мембрзнэ/буферный раствор; показать возможность образования в данных условиях разности граничных потенциалов за счет связывания ионов водорода на поверхности мембраны; показать, что зз счет эЕаргии связанных с поверхностью ионов водорода может быть совершена работа но создана» градиента ионов на ЕЯМ.
ІЙЇНіївЯ-й22їїзн_работьі. В ходе исследований било показано, что ' при создании на БЛ1.1 градиента попов калия или натрия и в отсутствие градизкта рН в НС трансмембранний поток коков водорода, индуцированный' соответственно нигерищшом или монесииом, возрастает с увеличением концентрации буфера (цитрат или kesj. в этих условиях методом компенсации внутримембранного поля продемонстрировали образование разности граничных потенциалов, обусловленное тек, что в процессе
ЧеОЛОКТрОГеїШОГО КОТИОН/ПГОТОШГОГО ('CbKliS ПРОИСХОДИТ СРЛЗНВЗН;:а ПЭ
поверхности мембраны чонсв кодороду. Образовяяич разности гуг.'П'Ц'Уі потенциалов зависит от липллнего оостяра т.чіран. іілЯгзку услоетя. 8 которых в отсутствие градкзитз рк я КС і"-ч.~<-?уется :- '-г'-х-лпга работы двух неэлектрогенгах клтпен/яротонпых '.Смсіїїтсоп іпіг'гр;гіі.лї.ч н мокия-сяна зз счет связанных непосредственно m поверхности кембрэни протоков.
П23кзв5кос_значение_работк. Нйстзл;та; песл^лов';!:".:'? л:<"Т !-оууг-информацию о возможности локального соїгряиння нрсцлст.оз ?лзг:трош:о-го транспорта и синтеза ATP в ксмбрзнахбэктериП, митохондрия ;: хлохеплзстов. Полученные результаты могут 6чї:> пс;:о.':ьгогзни лл.ч дальнейшего изучения механизмов преврацс;жя энергии в сопрягают:; мембранных системах.
АпЕо0ация_р.зботч. Резу^таты диссертационной работа докладывали на всесоюзной конференции "Трансформация энергии в мокбрзчльк системах" (Пущине, 1991) и ыа теоретическом семгсзарз отдела О.познзргет2ки НИИ физико-химической биология им. А.Н. Белозерского КТ'У (Москва. 1993).
Шй!Ш1Ш*і1- По материалам иесдедоватпги опубликовано 4 статьи.
Структура и объем диссертация. диессертзция состоит из введения, обзора литературы в трех главах, списания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения з егма главах, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложен» на 122 страницах, включая 29 рисунков. Библиография содержит и'.ь названия. ЗКСПЕШІЗГГАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .
Баслойиую липидпую меморэпу формировали на отверстии в тефлоново а стенке диаметром 0,3-0,4 ш по методу Мзаллерз и др. (Kuii« et 111,1962). Б большинстве экспериментов ^МбраіфОрМГфУНЩКЯ раствор
СОСТОЯЛ КЗ {ССфаТИДИЛХОЛШЗ і ЕЫДвЛеННОГО ИЗ СОеВЫХ боСов ("Sigma",
США), И ХОЛЗСТОріШа ("Boehrinqer", ФРГ) в ы-деканэ. В иекотрих случаях использовали фосфатидилсерин "Sigma", фосфатидилэтаноламин
"Пика" И ДКфИТааОИЛфОССаТйЦКЛХОЛІШ "Avanti Polar Lipido".
В процессе работы использовали буферы цитрат СРеахим") и hes ("r.erva"). Протонофор тетрахлортрифторлетилбвнзимидазол (Т'ІФБ) и монениш ("Caibiochem")добавляли к растворам с двух сторон мембраны в концентрации ЮМ и 10 Ы соответственно. Ионофор нигерицин ("Caibiochem") добавляли непосредственно в шмбрэнформпрущий раствор в концентрации 180 мкМ.
Тренсмембрашше потенциалы изморили методом разомкнутой цепи,
ИСПОЛЬЗУЯ уСИЛИТеЛЬ Keithey 301.
Граничные потенциалы на БЯМ при адсорбции ионов водорода измеряли ызтодом компенсации впутршембрашюго поля (Соколов,1930). Метод измерения граничного потенциала состоит в том, чтобы пайти величину' постоянного напряжения между водными растворами, при котором электрическое поле внутри мембраны отсутствует. Эта величина (компенсационный потенциал) совпадает с разностью граничных .потенциалов БЛМ. Епок-сіема установки для измерения компенсационного потенциала мембраны состоит из: ячейка, генератора ГЗ-П2 с используемой циклической частотой 395 Гц, фильтра второй гармоники типа 1617 (Германия) .усилителя тока Б5-8, активного- фильтра основной гармоники (разработка инженера Лебедева Е.Н.), селективного усилителя второй гармоники типа 237 (Польша).