Введение к работе
Актуальность темы. Развитие патологических процессов в организме практически всегда сопровождается накоплением эндогенных и/или экзогенных веществ, оказывающих токсическое действие или изменяющих направленность метаболических процессов. Для удаления этих продуктов и предотвращения токсикоза существует система, включающая в себя органные и молекулярные механизмы детоксикации. Важным звеном этих механизмов являются транспортные молекулы, в том числе альбумин крови - один из главных переносчиков низкомолекулярных гидрофобных и амфифильных веществ.
Ранее показано, что при ряде заболеваний способность альбумина связывать различные вещества изменяется [Чегер СИ. 1975, Brodersen R 1985-1989, Миллер Ю.И. 1990-1992]. Оценка связывающей способности альбумина важна для клинической практики. Конкуренция между лигандами за места связывания на альбумине может влиять на эффективность лекарственной терапии и проявление токсичности метаболитов.
Наиболее простым и доступным методом исследования свойств альбумина является метод флуоресцентных зондов, когда об изменении свойств альбумина судят по изменению интенсивности флуоресценции зонда. Одним из таких зондов является К-35, который при добавлении в сыворотку крови избирательно флуоресцирует из альбумина [Красовицкий Б.М. 1988, Айдыралиев Р.К. 1988, Миллер Ю.И. 1990]. Клинический метод исследования альбумина с помощью К-35 был разработан в НИИ ФХМ МЗ РФ и в течение последних 5-7 лет применяется во многих клиниках России [Миллер Ю.И. 1991, Добрецов Г.Е. 1991, Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е. 1994, 1998].
В многочисленных клинических исследованиях показано, что у здоровых людей значения интенсивности флуоресценции К-35, нормированные на концентрацию альбумина в сыворотке, в 1,1 - 2,5 раза выше, чем у больных. Этот эффект наблюдается при самых различных заболеваниях: неотложных состояниях и хирургических болезнях [Закс И.О., 1995, Федоровский 1994, Гринберг А.А. 1999, Родоман Г.В. 1999], болезнях сердца и сосудов, печени, легких [Арутюнов
Г.П. 1994, 1998, Андреева О.Л. 1998, Титов В.Н. 1999], при стоматологических [Андреева О.Л. 1998] и даже при психических заболеваниях [Мисионжник Э.Ю 1994, 1997, Гамалея Н.Б. 1998].
Молекулярные механизмы такой универсальной реакции и причины высокой чувствительности флуоресцентного теста к даже небольшим изменениям в состоянии здоровья остаются невыясненными. Раскрытие зтігх механизмов важно для понимания реакции организма на болезнь и для целей практической медицины - для интерпретации клинического теста, а также для решения вопросов тактики лекарственной терапии и детоксикации. Особенно актуален этот вопрос для оценки и прогнозирования эффективности терапии при психических заболеваниях, когда возможно развитие резистентности к терапии.
Таким образом, цель и задачи работы определяются требованиями медицинской практики, необходимостью раскрытия молекулярных механизмов теста, используемого в клинике.
Вопрос о причинах изменения интенсивности флуоресценции зондов в альбумине при заболеваниях стоит с 1952 года, когда Лоуренс предложил зонд ани-линонафталинсульфонат (АНС) и обнаружил, что интенсивность его флуоресценции у больных ниже, чем у здоровых. Возможны две причины: конкуренция зонда с другими лигандами альбумина и конформационные изменения связывающих центров самого белка без конкуренции. Обычно полагают, что доминирует первый механизм -конкурентный. [Миллер Ю.И. 1991, Добрецов Г.Е. 1992, Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е. 1994]. Однако некоторые данные, полученные при исследовании альбумина с зондом К-35 свидетельствуют о конформацион-ных изменениях связывающих центров при некоторых заболеваниях, в частности при шизофрении [Андреева О.Л. 1995, Мисионжник Э.Ю. 1997]. Возможно, конформационные изменения связывающих мест для К-35 индуцированы связыванием лигандов в других центрах.
Специального исследования, посвященного вопросам связывания К-35, изменения конформацнн связывающих центров для К-35 при связывании других лигандов проведено не было. Также оставались невыясненными молекулярные механизмы изменения флуоресценции зонда при шизофрении.
1~ .
Цель и задачи исследования. Целью диссертации было выяснение молекулярных механизмов высокой чувствительности флуоресценции К-35 к изменениям связывающих центров, вызванных в модельной системе — изолированном альбумине - и происходящим при патологических процессах в организме человека, выявление роли изменения конформации связывающих центров и конкуренции при связывании лигандов с альбумином в изменении интенсивности флуоресценции К-35.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
установить связь между изменениями сродства зонда К-35 к альбумину и интенсивностью флуоресценции К-35, определяемой в клинико-лабораторной практике, на примере доноров и больных шизофренией;
разработать метод, позволяющий одновременно и независимо исследовать связывание К-35 с альбумином и флуоресценцию зонда из этого белка;
исследовать влияние на связывание К-35 с альбумином важного физиологического лиганда - насыщенной жирной кислоты;
исследовать конкурентные и аллостерические влияния различных лигандов - маркеров "лекарственных" связывающих центров I и II - на взаимодействие К-35 с альбумином;
методом анализа затухания флуоресценции с временным разрешением 1(Г10 сек исследовать механизмы, приводящие к изменению интенсивности флуоресценции зонда на примере сывороток больных шизофренией.
Научная новизна работы. Впервые с использованием референтного метода равновесного диализа проведено исследование связывания К-35 с изолированным альбумином и с фракциями сыворотки. Показано, что в условиях клинического теста зонд К-35 при добавлении в сыворотку крови не только флуоресцирует из альбумина, но и связывается в основном с альбумином.
Разработан новый метод оценки связывания зонда с белком, позволяющий работать в широком диапазоне концентраций белка и в одном эксперименте исследовать как связывание, так и флуоресценцию зонда. Метод основан на безыз-лучательном переносе энергии возбуждения с комплекса (ортофталевый альдегид - белок) на зонд.
С помощью предложенного метода показано, что изменение концентрации альбумина в растворе в пределах 4-40 мкМ не влияет на связывание с ним К-35.
Исследовано влияние лигандов на связывание и квантовый выход флуоресценции К-35. Впервые выделен вклад изменений конформации связывающих центров в изменение интенсивности флуоресценции К-35. Показано однонаправленное совместное влияние изменения связывания и квантового выхода флуоресценции на интенсивность флуоресценции К-35. Определены условия, при которых интенсивность флуоресценции К-35 изменяется только в результате изменения квантового выхода флуоресценции, без нарушений связывания зонда.
Показано, что флуоресценция К-35 наиболее чувствительна к связыванию с альбумином насыщенных жирных кислот и маркеров центра I; при этом изменяются и связывание зонда, и его квантовый выход. Связывание маркеров центра II не влияет на связывание зонда, но оказывает в присутствии жирной кислоты влияние на квантовый выход флуоресценции К-35 путем аллостерического изменения конформации связывающего центра для К-35.
Впервые выявлены изменения связывающих центров альбумина крови больных шизофренией, не сопровождающиеся изменением связывания К-35. С помощью нового метода исследования процесса затухания флуоресценции К-35 с временным разрешением 10"10 сек показано, что механизм выявленных изменений состоит в перераспределения пулов ярко и слабо флуоресцирующих молекул К-35, связанных с альбумином, и отражает изменение микрогетерогенности альбумина.
Практическое значение работы. Предложена простая методика одновременного исследования связывания и флуоресценции зонда К-35. Определение параметров связывания при этом не зависит от флуоресцентных свойств зонда. Методика позволяет работать в широком диапазоне концентраций белка.
С помощью данной методики возможна быстрая оценка как изменения связывающих свойств, так и изменения конформации альбумина. Простота и невысокая стоимость каждого исследования позволяет использовать эту методику как в клинических, так и в лабораторных условиях.
Обнаруженные изменения конформации альбумина при психических заболеваниях, ведущие к изменению свойств белка, могут быть основой для разработки новых путей решения проблемы лекарственной резистентности, которая часто развивается в процессе терапии психических заболеваний.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 5 тезисов на конференциях.
Апробация работы. Фрагменты диссертации были доложены на Международных конгрессах по флуоресцентной спектроскопии (MAFS V, Берлин 1995; MAFS VI, Париж 1999), на Съезде биофизиков России (Москва, 1999), конференциях по использовании синхротронного излучения (СИ-1998, СИ-2000, Новосибирск), конференциях НИИ ФХМ (1998, 1999), совместном заседании отдела биофизики НИИ ФХМ и кафедры биофизики РГМУ (Москва, 2000).
Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение результатов, выводы, библиография. Работа изложена на ПО страницах, иллюстрирована 26 рисунками и 10 таблицами. Библиография содержит 245 работ отечественных и зарубежных авторов.