Введение к работе
~~~--0g-
Актуальность проблемы. Исследование влияния биогенных хлораминов на функциональную активность тромбоцитов представляет интерес в двух аспектах. Во-первых, N-хлорпроизводные аминокислот и таурина являются природными соединениями: они образуются в активированных нейтрофилах в результате реакции пшохлорнои кислоты с эндогенными аминокислотами fStelmaszynska Т., Zgliczynska J.M., 1974]. В ряде работ [Kim С, Park Е., Quinn M.R., Schuller-Levis G, 1996] показано, что N-монохлортаурин, являющийся сигнальной молекулой нейтрофилов, способен снижать образование тканеповреж-дающих медиаторов воспаления макрофагами (окиси азота, фактора некроза опухоли-а, простагландина Ег) за счет ингибирования процессов транскрипции и трансляции, и тем самым защищать собственные ткани от повреждения. В организме, в случае воспалительного повреждения эндотелия сосуда, происходит взаимодействие лейкоцитов и тромбоцитов. Продукты миелопероксидазной реакции оказывают влияние на функциональную активность тромбоцитов. Впервые противоагрегациониое действие N-хлорпроизводных аминокислот на тромбоциты было показано в работах нашей лаборатории [Мурина М.А., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И., 1989, 1992, 1995, 1997]. Во-вторых, гиперактивность тромбоцитов играет фундаментальную роль в развитии тромбоза, вазоспазма и атеросклероза, составляющих патогенетическую триаду сердечно-сосудистых заболеваний, которые по-прежнему являются основной причиной смертности населения развитых стран [Wu К.К., 1996]. В настоящее время существуют препараты, каждый из которых блокирует преимущественно одну функцию тромбоцитов: адгезию, агрегацию, секрецию. Таким образом, поиски нового антитромбо-цитарного препарата, сочетающего максимальную способность к угнетению активности тромбоцитов с минимальным повреждением других компонентов крови и организма в целом, продолжаются. В нашей лаборатории N-шорпроизводные аминокислот предложены как возможные антитромбоцитар-ные средства для предотвращения тромбозов, опосредованных тромбоцитами ТИурина М.А., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И., 1993]. Химическая модификация биогенными хлораминами плазматической мембраны тромбоцитов может шзывать генерализованное подавление адгезии, агрегации и секреции тромбоцитов. Известно, что N-хлораминокислоты способны химически модифицировать серосодержащие группы [Thomas G., 1986]. Эти группы обнаружены в лруктуре коллагенового, фибриногенового и аг-адренергического рецепторов таазматической мембране тромбоцитов [Siess W., 1989; Панченко Е.П., 1997] и іграют важную роль в процессах их адгезии и агрегации.
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в эценке эффективности противотромбоцитарного действия биогенных хлорами-юв на тромбоциты человека в зависимости от путей и механизмов их активации; присутствия других клеток крови; структуры хлораминовых производных шинокислот. В соответствии с этим предусматривалось решение следующих іадач:
1) Исследование угнетения активности тромбоцитов (агрегации и секре-
дии содержимого плотных гранул) под действием N-хлораминокислот в зависи
мости от их структуры и природы индуктора агрегации.
2) Сравнение эффективности противоагрегационного действия N-
;лораминокислот на нативные, предварительно активированные тромбоциты и
тетки в составе агрегатов.
3) Сравнительное изучение действия N-хлорпроизводных аминокислот и
таурина на функциональную активность тромбоцитов и эритроцитов.
4) Оценка эффективности антитромбоцитарного действия N-
хлорпроизводных аминокислот и таурина при их введении в цельную кровь че
ловека.
Научная новизна исследования. Было выяснено, что агрегация тромбоцитов кролика, вызванная различными индукторами (АДФ, коллагеном и адреналином), эффективно угнетается N-монохлорпроизводными аланина и фенилала-нина; при этом противоагрегационное действие N-хлораминокислот зависит от способа активации тромбоцитов: агрегация тромбоцитов, индуцированная коллагеном и адреналином и сопровождающаяся реакцией выброса плотных и сыгранул, подавляется N-хлораминокислотами в 2-5 раз эффективнее, чем АДФ-индуцированная агрегация.
Установлено, что N-хлорпроизводные аминокислот и таурина эффективно подавляют агрегацию как нативных, так и предактивированных тромбоцитов человека; при этом в условиях кратковременной инкубации тромбоцитов с N-хлораминокислотами, их противотромбоцитарное действие зависит от структуры N-хлораминокислот: N-хлораланин более эффективно подавляет агрегацию тромбоцитов, чем N-хлорфенилаланин. При увеличении продолжительности взаимодействия нативных и предактивированных тромбоцитов человека с N-хлорпроизводными аминокислот и таурина различия в эффективности их про-тивоагрегационного действия исчезают.
Показано, что секреторная активность тромбоцитов человека, отражающая выброс во внеклеточную среду содержимого плотных гранул и приводящая к каскадной активации форменных элементов крови, подавляется N-хлорпроизводными аминокислот и таурина в большей степени, чем агрегация.
Выяснено, что N-хлорпроизводные аминокислот и таурина, введенные в цельную кровь человека, проявляют высокую избирательность противоагрега-ционного действия на тромбоциты; при этом не наблюдается повреждения эритроцитов, регистрируемого по критериям гемолиза и изменения их агрегацион-ной способности. Эритроциты человека модифицируются ^№дихлортаурином в количествах, на 2-3 порядка выше требуемых для угнетения агрегации тромбоцитов.
Установлено, что N,N-,areuiopTaypHH способен подавлять начальную агрегацию тромбоцитов человека и вызывать полный распад образовавшихся агрегатов.
Показано, что Н^дихлортаурин и общепринятые антитромбоцитарные препараты аспирин и тиклопидин при введении в кровь человека одинаково эффективно подавляют агрегацию тромбоцитов.
Практическое значение работы. С одной стороны изучение влияния биогенных хлораминов на функциональную активность тромбоцитов и эритроци тов представляет интерес с точки зрения перспективы получения нового антит ромбоцитарного препарата для предотвращения тромбозов, опосредованны? тромбоцитами. Потенциально возможным кандидатом на эту роль являете* N,N-flHxnopTaypHH (ДХТ), который характеризуется значительной химическо? устойчивостью. ДХТ эффективно подавляет начальную и конечную агрегацик тромбоцитов человека, и реакцию выброса содержимого плотных гранул. П$і введении ДХТ в цельную кровь человека значительное ингибирование агрега ции тромбоцитов не сопровождается заметным повреждением эритроцитов Важным достоинством ДХТ следует также считат* его способность подавляті
.>
агрегацию спонтанно и экзогенно активированных тромбоцитов человека и вызывать полный распад образовавшихся агрегатов. С другой стороны, таурин in vivo составляет 70 % от свободных аминокислот, содержащихся в нейтрофилах, и является "ловушкой" гипохлорит-аниона, предохраняя клетки крови от цито-токсического и цитолитического действия гипохлорной кислоты. В результате образуется долгоживущий хлортаурин. Поэтому большой интерес представляет исследование закономерностей действия ДХТ на функциональную активность тромбоцитов и эритроцитов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на V Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, апрель 1998 г., на II Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов", Воронеж, июль 1998 г., на V Международной конференции "Биоантиоксидант", Москва, ноябрь 1998 г.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 139 страницах, содержит 25 рисунков и 10 таблиц, состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Заключение" и выводов. Список литературы включает 231 наименований.