Содержание к диссертации
Введение
Часть 1. Обзор литературы 8
1. Энергия липидной поры 8
2. Электрический пробой мембран 12
3. Липидные поры при фазовом переходе 16
4. Температурный фазовый переход мембранных липидов 23
5. Липидные поры и проницаемость мембран 26
6. Оценка количества возникающих липидиых пор 34
Часть 2. Материалы и методы 36
1. Калориметрические измерения 36
2. Методика формирования бислойных липидиых мембран 41
3. Установка для измерений электрических характеристик БЛМ 41
4. Определение размера липидиых пор 44
Часть 3. Электрическая емкость бислойных липидиых мембран .50
Часть 4. Экспериментальное исследование мягкой порации липидного бислоя 53
1.Термограммы БЛМ из ДПФХ в растворах одновалентных катионов 53
2. Электрическая емкость пБЛМ при температуре фазового перехода ДПФХ 59
3.Флуктуации тока пБЛМ при температуре фазового перехода из ЖКС в гель 61
4.Вольтамперная характеристика пБЛМ из ДПФХ при температуре основного фазового перехода 66
5.Ионная селективность чисто липидной поры 69
б.Количественная оценка радиуса липидной поры 73
7. Краевое натяжение пор 77
Обсуждение 81
Выводы 87
Литература 89
- Температурный фазовый переход мембранных липидов
- Установка для измерений электрических характеристик БЛМ
- Электрическая емкость бислойных липидиых мембран
- Электрическая емкость пБЛМ при температуре фазового перехода ДПФХ
Введение к работе
Широкое применение в экспериментальной биологии и медицине в настоящее время получили различные методы преодоления основного структурного барьера живой клетки -липидного бимолекулярного слоя. Они играют ключевую роль при направленной доставке лекарственных веществ и генетического материала, слиянии мембран в целях биотехнологии, ожоговых и низкотемпературных воздействиях, а также массивном радиационном облучении тканей [72]. Значительный интерес в патологии представляют исследования биофизических механизмов рождения и залечивания пор, возникающих в липидном бислое [95]. В медицине получили широкое распространение методы, основанные на использовании обратимого электрического пробоя мембран в сильном электрическом поле [1, 32]. В последнее время все большее внимание уделяется методам мягкой порации липидного бислоя при фазовых превращениях мембранных липидов [34], осмотическом набухании липидных везикул [89], механическом натяжении липидного бислоя [55]. Биофизический механизм всех видов порации включает в качестве необходимого элемента превращение первичной гидрофобной поры в гидрофильную пору с последующим ростом поры до критического уровня и разрывом бислоя, или восстановлением структуры бислоя в результате затекания поры. Возможность диффузионного затекания пор принципиально отличает липидную пору от многочисленных белковых пор, где механизм затекания отсутствует. Эффективное затекание липидных пор лежит в основе устойчивости клеточных мембран при различных
патологических изменениях клеточной структуры, а критерий критической поры может быть использован для количественной оценки устойчивости бислоя [4].
В отличие от электропорации, методы мягкой порации исследованы недостаточно. Следует отметить, что электропорация сопряжена с необходимостью использования электрического пробоя бислоя, что не может не сказаться на физиологических свойствах клеточных мембран, клеток в целом и включенным в липидные везикулы лекарств и генетического материала. Поэтому все больший интерес представляют методы мягкой порации, из которых технически наиболее прост метод порации, основанный на структурных изменениях при фазовом переходе мембранных липидов. Порация, основанная на фазовом переходе мембранных липидов имеет самостоятельное значение, поскольку обнаружена взаимосвязь между температурой обитания пойкилотермных животных и липидным составом клеточных мембран [68].Эта зависимость прослеживается также у бактерий [12]. У гомойотермных животных важную роль в физиологии сна играет изотермический фазовый переход липидов, индуцированный ионами Са [64] .В клинической медицине широкое применение нашел метод сочетанного действия гипертермии опухоли с введением в нее нагруженных антибиотиками липосом. Липидный бислой липосом образован липидами с фазовым переходом в области гипертермических температур. Это способствует эффективному освобождению антибиотка непосредственно в опухоли [65].
В области биофизики ионных каналов в течение последних нескольких лет достигнут существенный прогресс. Частично это обусловлено достижениями рентгеноструктурных исследований
мембранных белков и липидов [77], установки генетически обусловленного синтеза некоторых канальных белков [33], а также компьютерного моделирования работы одиночных ионных каналов [79, 80]. Эти достижения значительно расширили наши представления о молекулярной структуре ионных каналов. Однако функциональные особенности работы каналов остаются до настоящего времени недостаточно изученными.
Изучение ионных токов, текущих через одиночные каналы в клеточной мембране является традиционным методом изучения функциональных особенностей ионных каналов. До настоящего времени эта техника является наиболее надежным и проверенным способом регистрации электрической активности клеток [27].
В последнее время широкое применение в экспериментальной биологии и медицине получила электропорация клеточных мембран [72]. Как известно, в основе электропорации лежит явление обратимого электрического пробоя липидного бислоя [46,47]. Ранее в работах В.Ф.Антонова и соавторов [34] было обнаружено принципиальное сходство в эволюции липидных пор, возникающих при электропорации и фазовом переходе липидов. Одиночные липидные проводящие поры в плоских бислойных липидных мембранах (пБЛМ), обнаруженные впервые при фазовом переходе дистеароилфосфатидилхолина из жидкокристаллического состояния в гель [34], имеют общий с электропорацией механизм возникновения, обусловленный превращением гидрофобной поры в гидрофильную с последующим затеканием ее или разрывом бислоя. Развитие поры зависит от критических параметров: энергетического барьера и критического радиуса поры.
Развитие методов прижизненной порации клеточных мембран сопряжено с необходимостью создания наряду с электропорацией других методов, лишенных очевидных недостатков электропорации. С учетом вышеизложенного предпочтение все более отдается методам мягкой порации. Основной целью работы являлось экспериментальное исследование явления мягкой порации липидных мембран, основанного на структурных перестройках липидного бислоя в результате фазового перехода мембранных фосфолипидов из жидкокристаллического состояния в гель-состояние. Важной особенностью мягкой порации в отличие от электропорации является то, что помимо отсутствия электрического пробоя бислоя, структурные перестройки клеточных мембран, сопряженные с фазовыми переходами мембранных липидов, протекают при физиологических температурах. В случае изотермического фазового перехода заряженного бислоя, обусловленного ионами Са2+, требуются физиологические концентрации двухвалентных ионов [5]. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
исследовать электрические характеристики (интегральную проводимость, флуктуации тока и электрическую емкость) пБЛМ при фазовом переходе липида;
провести калибровку размера одиночных липидных пор с использованием в качестве пробных частиц электронейтральных полимерных молекул полиэтиленгликоля в диапазоне радиусов от 0,60 нм (ПЭГЗОО) до 2,10 нм (ПЭГ6000) с шагом -0,15 нм;
исследовать ионную селективность одиночных липидных пор в ряду одновалентных катионов: Li+, Na+, К+, Rb+, Cs+;
проверить оценочные параметри теории Freeman et al., для расчета краевого натяжения чисто липидной поры.
Температурный фазовый переход мембранных липидов
Замораживание липидного бислоя в результате фазового перехода из жидкокристаллического состояния в гель сопровождается появлением липидных пор [34]. Очевидно, что, как и в случае с электрическим пробоем, судьбу мембраны будет определять соотношение радиусов образовавшихся пор и критических пор для данного состояния бислоя.
Фазовый переход пБЛМ в случае мягкой порации осуществляется при малых мембранных потенциалах порядка 0,05 В. как видно на рисунке 3, при таких напряжениях вкладом электрического поля в дестабилизацию мембран можно пренебречь. В соответствии с формулой (3) единственной причиной уменьшения критического радиуса поры могло стать либо уменьшение в результате фазового перехода у, либо увеличение ст. Считается, что у является величиной, мало зависящей от фазового перехода. Речь таким образом может идти только об определении величины поверхностного натяжения бислоя для двух фазовых состояний. Оказалось, что замораживание бислоя приводит к росту поверхностного натяжения для всех изученных липидов. Для гидрированного яичного лецитина ст возрастало от 1,1-10 3 до 5,610" Н/м. С учетом этого по формуле (2) была рассчитана зависимость энергии поры от ее радиуса в жидкой и твердой мембранах (рис. 5).
Как следует из рисунка 5 , критический радиус поры в критическом состоянии значительно меньше по сравнению с жидкокристаллическим состоянием и по абсолютной величине не превышает 2 нм. Сохранение длительной устойчивости липидного бислоя в гель-состоянии свидетельствует о том, что существующие поры и поры, возникающие при фазовом переходе, имеют размеры меньше 2 нм. Сравнение рисунков 3 и 5 демонстрирует высокую эффективность метода температурной обработки бислойных липидных мембран с целью получения популяции липидных пор сравнительно с электрическим пробоем. Действительно, замораживание мембранных липидов в ходе фазового перехода, что для многих динасыщенных липидов происходит при комнатной температуре, эквивалентно электрическому пробою мембраны внешним электрическим полем напряжением 0,5 В. В то же время очевидно, что электрические воздействия более удобны с точки зрения калибровки силы воздействия и его длительности.
Обобщая приведенные данные, можно утверждать, что любое воздействие механической, физической или химической природы, затрагивающее поверхностное натяжение липидного бислоя, является фактором риска в стабилизации пор-содержащих мембран. Развитие такого подхода позволяет получить количественный ответ на важный для биологии вопрос о вероятности разрушения или залечивания мембран при типичных стрессовых состояниях живой клетки.
На рисунке 5 показано, что критический радиус пор в мембранах, находящихся в жидкокристаллическом состоянии при отсутствии внешних воздействий, достигает 9 нм. Эта величина настолько значительна, что вероятность механического разрыва клеточных мембран в физиологических условиях очень мала. Разрыв мембраны, находящейся в таком состоянии, возможен лишь тогда, когда пора приобретает размеры, соизмеримые с толщиной мембраны. Опыт показывает, что полное разрушение липидного бислоя возможно лишь при грубых механических манипуляциях или необратимом электрическом пробое.
Важный практический вывод состоит в том, что, опираясь на данные о критических радиусах пор (рис. 3 и 5), можно предсказать судьбу клеточных мембран в различных стрессовых состояниях (табл. 2).
Первый вывод, который можно сделать, заключается в том, что реальные поры во всех случаях меньше критического размера пор, характерного для жидкокристаллического состояния мембранных липидов. Действительно, размеры критических пор для липидного бислоя в жидкокристаллическом состоянии (9 нм) значительно превышают размеры реальных пор, указанные в левом столбце. Таким образом, мембраны в различных стрессовых состояниях обладают значительным запасом прочности. Второй вывод: действие электрического пробоя и замораживания бислоя, как видно в последней строке, аддитивно. Такого результата можно ожидать, следовательно, и при других сочетаниях физических, а также химических воздействий. Стрессовое состояние, таким образом, независимо от их физико-химической природы может быть количественно оценено, и его результат предсказан в рамках рассматриваемой модели. Третий вьюод касается частного случая гемолиза эритроцитов. Ранее было показано, что критический радиус поры в липидном бислое при температурном фазовом переходе (см. рис.5) достигает 2 нм, что совпадает с радиусом пор эритроцита при осмотическом гемолизе. Этот результат может объяснить известный в криобиологии факт гемолиза эритроцитов при оттаивании замороженных клеток в изотонических условиях. Из таблицы 2, кроме того, следует, что простое замораживание мембранных липидов может привести к гемолизу. Помимо криобиологии фазовый переход мембранных липидов играет важную роль в холодоустойчивости растений [5, 36].
Установка для измерений электрических характеристик БЛМ
Для решения задач, поставленных в работе, было необходимо измерить электрические параметры мембраны - проводимость и емкость в различных условиях. Регистрацию электрических сигналов проводили прибором для измерения ионных токов (Пущино, Россия). Для определения емкости мембраны на нее необходимо подать переменное напряжение. В нашем случае на мембрану подавалось пилообразное напряжение частотой/=2 Гц и удвоенной амплитудой в диапазоне напряжений 10-200 мВ.
Записывались вольт-амперные характеристики мембран, регистрируемые в режиме подачи пилообразного напряжения на мембрану с помощью генератора сигналов специальной формы Г6-15 (рис.9). В этом режиме определялась интегральная проводимость мембран. Была разработана компьютерная программа для обработки вольтамперных характеристик (ВАХ). По ним рассчитывалась проводимость и емкость в растворах указанных выше электролитов.
На рис.10 представлены линейные участки ВАХ мембран при температуре фазового перехода ГЯЛ в растворах изучаемых электролитов. Видно, что вольтамперные характеристики, независимо от природы используемого электролита, линейны в диапазоне напряжений ±80мВ, а их наклон прямо пропорционален электрическому сопротивлению мембраны.
Интегральную проводимость пБЛМ рассчитывали по формуле: где UQ - измеряемое напряжение, обусловленное проводимостью мембраны, Ro - сопротивление обратной связи, U0 - амплитуда подаваемого на мембрану напряжения. Расчет емкости См производили по формуле: где Uc - измеряемый скачок напряжения, обусловленный емкостью мембраны,/ частота.
Регистрацию флуктуации тока в зоне температурного фазового перехода липида производили в режиме фиксации напряжения. Схема установки приведена на рис.11.
В оба отсека кюветы были помещены хлорсеребряные электроды с низким сопротивлением. Межэлектродная разность потенциалов не превышала ±2 мВ. Один из электродов был подключен к генератору, второй замкнут на землю. Напряжение с генератора полностью падает на мембране, имеющей сопротивление, многократно превышающее сопротивление электродов и электролита. Сигнал усиливался и подавался на плату компьютера, выводился на экран и записывался на диск. Для записи трансмембранного тока использовали, как правило напряжение ±50 мВ. Установка позволяла измерять флуктуации тока амплитудой до 0,5 пА. На рис.12 представлен фрагмент записи трансмембранного тока в режиме фиксации потенциала.
Основной метод оценки радиуса поры обусловлен омической природой липидных пор. Рассматривая пору как цилиндрическую трубку, заполненную раствором электролита, можно оценить радиус поры по амплитуде регистрируемых флуктуации тока по формуле: где Gp - проводимость поры, /Р=5 нм - толщина пБЛМ, g - удельная проводимость раствора электролита.
Электрическая емкость бислойных липидиых мембран
По данным рентгеноструктурного анализа фазовый переход жидкое-твердое сопровождаются значительным утолщением бислоя, благодаря переходу жирнокислотных радикалов молекул фосфолипидов в полностью транс-положение. Для обнаружения фазового перехода в пБЛМ нами был использован метод измерения электрической емкости. На БЛМ подавали треугольные импульсы с частотой j=Q,2S Гц. Регистрировали циклические вольтамперные характеристики, состоящие из омической и емкостной составляющих. Напряжение, подаваемое на БЛМ, не превышало Umax=±30 мВ. Для расчета удельной емкости БЛМ с помощью окуляр-микрометра измерялся радиус БЛМ за вычетом торуса. Типичная циклическая вольтамперная характеристика БЛМ показана на рис. 13.
С учетом обнаруженного пика на термограмме ГЯЛ схема эксперимента предусматривала изменение температуры в кювете в диапазоне 40-60С. Температура устанавливалась с помощью полупроводникового термоэлемента. Для измерения температуры вблизи БЛМ использовалась термопара. Режим циклического охлаждения-нагревания обеспечивался охлаждением со скоростью 1С/мин и нагревом со скоростью 40С/мин.
На рис.14 показаны результаты измерения емкостного тока БЛМ из ГЯЛ при изменении температуры в диапазоне от 60 до 40С. Представлено семейство циклических вольтамперных характеристик, полученных в автоматическом режиме с частотой 0,25 Гц при понижении температуры. Рис. 14. Семейство нестационарных вольтамперных кривых БЛМ из гидрированного яичного лецитина при изменении температуры в диапазоне 60С - 40С.
Запись производилась в автоматическом режиме на двухкоординатном самописце. Напряжение развертки С/тах=±30 мВ, частота развертки /=0,25 Гц. Площадь БЛМ за вычетом торуса - 1 мм2. Измерение тока проводились усилителем с сопротивлением обратной связи R0=10S Ом. Замораживание БЛМ проводили со скоростью 1С/мин.
Основной целью нашего исследования было экспериментальное изучение механизма рождения и эволюции липидных пор в условиях фазового перехода липидов в БЛМ из ЖКС в гель при малом непробойном электрическом напряжении на мембране. В качестве объекта изучения был выбран цвиттерионный ДПФХ, один из основных фосфолипидов клеточной мембраны.
В данном разделе нашей работы приведены результаты измерений термограмм БЛМ из ДПФХ, электрической емкости, записи флуктуации тока плоских БЛМ, сняты вольтамперные характеристики единичной липидной поры. Все измерения проведены при температуре основного фазового перехода ДПФХ, что позволило оценить проводимость индивидуальных липидных пор, их количество и размеры. Размеры пор измеряли методом исключения объема с помощью полиэтиленгликоля различной молекулярной массы от ПЭГ-300 до ПЭГ-6000. Экспериментально получен ряд селективности одновалентных катионов, начинающийся с Li+, соответствующий XI ряду селективности в классификации Эйзенмана [51].
На рис. 15а представлена типичная термограмма суспензии липосом из ДПФХ в растворах 1 М хлоридов Li+, Na+, К+, Rb+, Cs+. На кривой видны два пика: пик предперехода при 35,5С и пик основного фазового перехода из ЖКС в гель при 41 С.
Положение пиков одинаково для всех солей, кроме LiCl. На рис. 156 показано смещение обоих пиков в область более высоких температур при формировании БЛМ в растворе 1 М LiCl: пик основного фазового перехода смещается до 43С и пик предперехода до 40С. Это свидетельствует о более сильном взаимодействии Li+ с полярными группами молекул ДПФХ по сравнению с другими катионами, что, возможно, приводит к более плотной упаковке бислоя. Аналогичный сдвиг наблюдался ранее Cunningham et. al., [48].
Наличие пика предперехода на термограмме связывают с наличием в липидном бислое определенного количества дефектов, выявляемых при температуре близкой к температуре основного фазового перехода [70]. Когда температура приближается к температуре перехода в липидном бислое образуются малые случайно расположенные плотноупакованные области, которые формируют сравнительно упорядоченную гель-решетку.
Электрическая емкость пБЛМ при температуре фазового перехода ДПФХ
По данным рентгеноструктурного анализа [73] толщина липидного бислоя из ДПФХ при фазовом переходе из ЖКС в гель возрастает от 3,9 до 4,7 нм, т.е. приблизительно на 17%. Поскольку состояние основного растворителя мембраны н-декана при этой температуре не изменяется, то можно ожидать приблизительно такого же уменьшения емкости в предположении постоянства диэлектрической проницаемости и площади пБЛМ. Полученные экспериментально данные, показанные на рис. 16, подтверждают это предположение.
На рисунке видно, что действительно, в области основного фазового перехода ДПФХ имеет место снижение электрической емкости приблизительно на 14 %, что можно считать хорошим совпадением с данными рентгеноструктурного анализа [73], свидетельствующими об утолщении бислоя в результате перехода жирнокислотных радикалов в полностью транс-конформацию.
Полученные в данном эксперименте результаты измерения электрической емкости пБЛМ из ДПФХ при температуре фазового перехода липида проверялись позднее в опытах Богейм, Ханке, Эйбл [44] с фосфолипидом 1-стеароил-3-миристоил-глицеро-2-фосфохолин, имеющим более низкую точку фазового перехода.
Кроме этого, пБЛМ формировались, в отличие от наших экспериментов, по методике Монтала-Мюллера [78], согласно которой БЛМ формируется из двух монослоев без использования растворителей. Эти авторы получили близкие результаты. Совпадение наших результатов позволяет прояснить дискуссию, инициированную Mclntosh&Simon [75], показавших в опытах с липосомами, что используемый нами растворитель н-декан может сдвигать температуру основного фазового перехода. Авторы обратили внимание на то, что в наших опытах предполагаемого сдвига изменений электрической проводимости и емкости не наблюдалось. В действительности авторы не учли того обстоятельства, что в плоском бислое растворитель распределяется неравномерно и быстро уходит в торус, оставляя бислой практически без растворителя. Совпадение наших данных с данными Богейм, Ханке, Эйбл, в опытах которых растворитель вообще не использовался, свидетельствует в пользу нашей трактовки полученных данных.
Ранее было обнаружено, что снижение температуры БЛМ из индивидуального динасыщенного 1,2-дистеароил-8П-глицеро-3-фосфохолина сопровождается появлением флуктуации тока в области температуры основного фазового перехода, что свидетельствует о рождении чисто липидных пор [34]. Эти данные были подтверждены в работе [44] с другим цвиттерионным фосфолипидом 1-стеароил-З-миристоил-глицеро-2-фосфохолином при температуре фазового перехода этого липида. Позднее удалось сформировать пБЛМ из фосфатидной кислоты и наблюдать флуктуации тока, индуцированные ионами Са в изотермическом режиме [35].
На рис. 17 представлены записи отдельных флуктуации тока, регистрируемые нами в режиме фиксации напряжения на пБЛМ из ДПФХ при различных фиксированных температурах. Как видно на рис. 17а, флуктуации тока при температуре, превышающей температуру фазового перехода (50С) практически отсутствуют и на гистограмме распределения тока (справа) единственный максимум лежит в области нулевых значений тока. Флуктуации тока отсутствуют и при температуре ниже фазового перехода.
При температуре основного фазового перехода, поддерживаемой термостатом с точностью 0,5С, наблюдаются хорошо разрешенные флуктуации тока большой амплитуды. Длительность одиночных флуктуации может, достигать нескольких секунд (рис. 176). Помимо одиночных регистрируются двух и трехуровневые флуктуации тока. На гистограмме токов (справа), помимо нулевого значения, видны два максимума распределения. Этот результат указывает на формирование кластера и/или коалесценцию пор. Такое предположение подтверждается видом гистограммы токов при 1,5 и 3 нА.
Ранее в опытах с пБЛМ из гидрированного яичного лецитина было установлено [2], что флуктуации тока, обусловленные одиночными липидными порами, имеют экспоненциально распределенные времена жизни пор в закрытом состоянии, что свидетельствует о независимом появлении липидных пор. С учетом этого предполагалось независимое существование пор.
