Введение к работе
Актуальность проблемы. Оптическое излучение длинноволновой ультрафиолетовой ( УФ ) и видимой областей спектра ( 300 - 700 нм является факторо окружающей среды, постоянно оказывающим воздействие на организмы. Поэтому познание молекулярных механизмов фотобиологических процессов, происходящих в биологических системах при поглощении квантов этих видов излучения, имеет большое обще-биологическое значение.
Хорошо известны достижения в области изучения природы таких фундаментальных процессов, как фотосинтез, зрительная фоторецепция, фотобиоэнергетика, опосредованная бактериородопсином, и фотоморфогенез, контролируемый фитохромной системой. В этой области полностью подтвердился принцип единства молекулярных механизмов их начальных фотофизических стадий, которые основаны на эле-ктронно-конформационных взаимодействиях в фотоактивном хромофорном комплексе.
Значительные успехи достигнуты также в расшифровке молекулярных механизмов повреждающего действия на биоструктуры коротковолнового УФ-излучения < < 300 нм ), которое вследствие прямого поглощения нуклеиновыми кислотами и белками, эффективно индуцирует протекание в них деструктивных фотохимических реакций. Что касается света более длинноволновых участков оптического спектра, то полученные данные о его повреждающем действии на биологические системы ( в отсутствие экзогенных сенсибилизаторов ) носят в основном феноменологический характер.
Вместе с тем происходящие в последнее время изменения в экологической обстановке, затрагивающие и облученность организмов, требуют детального изучения общих закономерностей и молеку-
лярных механизмов биологического действия длинноволнового УФ-излучения ( 300 - 400 нм ) и видимого света ( 400 - 700 ни ), являющихся экологическими компонентами солнечной радиации. К такого рода изменениям можно отнести повышение уровня загрязнённости окружающей среды, увеличивапцее вероятность протекания фо-тосенсибилизированных деструктивных реакций в клетках, и рост интенсивности биологически наиболее активных УФ-лучей солнца ( 300 - 320 нм ) в биосфере в результате частичного разрушения озонового слоя атмосферы. Среди многих экологических последствий разрушения озона особое значение придаётся тому, что дахе слабое повышение интенсивности УФ-сэзта приведёт к резкому увеличению образования рака кожи у людей под действием солнечной радиации.
Для успешного решения вопросов, связанных с выяснением механизмов и особенностей взаимодействия "экологических" видов оптического излучения с живой клеткой, принципиально важно изучать ве только действие света отдельных областей спектра, но и эффекты комбинированного действия света различных длин волн. Это вызвано тем, что между различными фотоиндуцированннми реакциями могут происходить определённые взаимодействия ( как санергические, так и антагонистические ), которые отразятся на конечном фотобиологи-ческом эффекте в целом.
Актуальность-проблемы комбинированного действия света определяется, с одной стороны, условиями реальной экологической ситу-
Коротковолновое УФ-излучение солнца поглощается озоном атмосферы и поверхности Земли не достигает.
ации, когда имеет место одновременное облучение живых систем различными видами излучений, а, с другой - необходимость!) создания новых способов защиты биологических объектов от повреждающего действия излучений, в том числе лазерных источников УФ-диапазона. Последние находят всё более широкое применение в биологии и медицине, и это остро ставит вопрос как о защите биологических систем от интенсивного лазерного УФ-излучения, так и выяснении специфики его повреждающего действия на клетки.
Несмотря на значительный интерес к указанным проблемам биологического действия оптического излучения и несомненную важность исследования перечисленных выше фотобиологических процессов, их молекулярные механизмы, особенно у эукариотных клеток, изучены мало, а о некоторых эффектах сведения вообще отсутствуют. В значительной мере это обусловлено сложным характером взаимодействия света с живой клеткой. Есть основания полагать, что конечное проявление фотобиологического эффекта будет определяться не только параметрами облучения и природой фотоактивных хромофоров в клетке, но также конкретным местом их локализации, особенностями клеточных структур, где протекают начальные стадии фотопроцессов, и возможностью их взаимодействия.
Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в выявлении и изучении природы деструктивных и защитных фотобиологических реакций при комбинированном действии оптического излучения различных длин волн на эукаряотные клетки. В соответствии с этим были поставлены следующие основные задачи :
-провести сравнительный анализ повреждающего действия на клетки УФ-излучения лазерного и обычного источников и выяснить природу и особенности образования лазер-индуцированных продуктов в ДНК;
-изучить механизмы деструктивного действия на клетки оптического излучения длинноволновой УФ и видимой областей спектра, в том числе найти фотоактивные хромофоры и сенсибилизаторы в клетках, а также определить первичные фотопродукты, ответственные за развитие конечных повреждающих эффектов;
-исследовать фотобиологические эффекты при комбинированном действии на клетки света различных длин волн, выявить фотозащитные системы в клетках и изучить молекулярные основы их функционирования.
Научная новизна. Работа представгяэт собой первое систематическое исследование молекулярных механизмов деструктивных и защитных фотобиологических реакций при комбинированном действии оптического излучения разных длин волн на клеточные системы. В( ней получены новые данные об основных закономерностях и особенностях повреждающего действия на клетки дрожжей "экологических" видов оптического излучения и высокоинтенсивного лазерного УФ-излучения, а также о природе фотобиологических эффектов, выявленных при комбинированном действии света разных длин волн на клетки, - фотозащиты и фотосинергизма. Наиболее важными результатами исследования представлят ются следующие:
выявление специфики повреждающего действия внсокоинтенсивного лазерного УФ-излучения по сравнению с действием низкоинтенсивного УФ-света обычных источников, которая выражается в увеличении степени фотоинактивации клеток с ростом интенсивности лазерного излучения и обусловлена протеканием в ДНК двухквантовых фотохимических реакций, приводящих к образованию ряда новых повреждений, не наблюдающихся в условиях низкоинтенсивного УФ-облучения;
установление связи летального действия длинноволнового УФ-света
/320-400 нм/ с протеканием деструктивных фотодинамических процессов в ДНК, основным инициатором которых является супероксидный анион-, радикал кислорода /0^/, генерируемый локализованным в ядерных структурах клеток НАДН;
выяснение механизма фотодинамической инактивации клеток видимым светом /400-600 нм/ в отсутствие экзогенных сенсибилизаторов, включающего следующие последовательные реакции: поглощение света эндогенным сенсибилизатором /идентифицирован как протопорфирин/, фотогенерация протопорфирином синглетного кислорода / Or/, инициация деструктивных процессов в плазматической мембране /основная мишень фотодеструкции/, нарушение ее проницаемости и других функциональных свойств, гибель клетки;
обнаружение у ряда представителей дрожжевых организмов новых эффектов фотозащиты от летального действия УФ-лучей /254, 313 нм/ и ионизирующего /рентгеновского/ излучения и доказательство связи этих эффектов с фотоактивированным ферментативным синтезом серотонина; выяснение молекулярного механизма защитного действия серотонина в качестве протектора ДНК от УФ-индуцированннх повреждений;
обнаружение эффекта взаимодействия двух фотобиологических процессов у дрожжей - фотоиндуцированного биосинтеза серотонина и ферментативной фотореактивации, проявляющегося в ингибировании фотореактивации и изменении структуры ее- сцектра действия; распсфровка механизма этого эффекта, в основе которого лежит связывание серотонина с УФ-облученной ДНК и ингибирование работы" фермента фотореак-тнвации по фоторасщеплению шгримидиновых димеров;
обнаружение фотосинергического летального эффекта при комбинированном /или совместном/ действии на клетки длинноволновых УФ-лучей /337, 365 нм/ и видимого света /400-1600 нм/; объяснение явлений фотосинергизма с позиций взаимоусиления фотодеструктивннх реакций, которые протекают в разных внутриклеточнцх структурах и индуцируются различными эндогенннаи сенсибилизаторами.
Научночірактичеокая значимость.Работа выполнена в плане одной из ключевых проблем современной биофизики, связанной с изучением фундаментальных механизмов взаимодействия света с живой клеткой и устойчивости биологических систем к повреждающему действие оптического излучения. Полученные экспериментальные данные и теоретические обобщения создают основу для понимания этих механизмов, а также открывают перспективы разработки новых подходов к решению вопросов практического применения оптического излучения в микробиологической промышленности, медицине и сельском хозяйстве. Установленный в работе фак^ фотоактивированного ферментативного синтеза серотонина ( процесс фотозащитн ) имеет непосредственное практическое значение как в связи с проблемой защиты биологических объектов от.повреждающего действия различных излучений, так и в аспекте поиска новых путей направленной регуляции клеточного метаболизма с целью получения физиологически активных веществ в биотехнологических процессах.
Материалы диссертации положены в основу курса лекций, читаемого автором студентам каф. биофизики биологического факультета МТУ, я нашли отражение в учебнике А.Б.Рубина "Биофизика", 1987, М.: Высшая школа. Результаты работы и разработанные жсіщіаи используются при проведении научных исследований в институте БНИИсинтезбелок, на каф. биофизики ТІУ, в НИИФ ЛГУ и др. институтах.
Апробация -работы. Основные результаты диссертации были доложены и обсуждены: на 7-й и 11-й Всесоюз. конференциях по когерентной и нелинейной оптике Дбилиси, 1976г. и Ереван, 1982г./, 1-м Всесоюз. симпозиуме "Фотобиология животной клетки "/Ленинград,1977г./, 11-м- Всесоюз. совещании "Биологическое действие УФ излучения"/Киев, 1979г./, Всесоюз. семинаре-совещании "Применение лазеров в биоло-
гии" /Тбилиси,1980г./, 1-м Всесоюз. биофизическом съезде /Москва, 1982г./, Всесоюз. научном совещании "Применение лазеров в биологии" /Москва,1983г./, Всесоюз. конференции "Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения" /Ялта,1984г./, 5-й Всесоюз. конференции по спектроскопии биополимеров /Харьков,1984г./; на 12-к Междунар. ботан. конгрессе /Ленинград,1975г./, Междунар. симпозиуме ФЕМО "Регуляция микробного метаболизма факторами внешней среды" /Пущино,1983г./, 1-м болгаро-советском симпозиуме "Свободные радикалы и биостабилизаторы". /София, 1987г./; на выездной сессии межфакультетского координационного совета МГУ по биофотони-ке "Проблемы биофотохимии" /Пущино,1974г./, рабочем совещании научного совета по радиобиологии АН СССР "Комбинированное действие ионизирующей радиации, физических и химических факторов на биологические объекты" /Москва,1980г./, школе-семинаре "Современные проблемы биофизики" /Пущино,1981г./, круглом столе научного совета по фотосинтезу и фотобиологии растений АН СССР "Некоторые аспекты не-фотосинтетического действия света на растения" /Пущино,1986г./, научно-практической конференции "Экстремальные условия существования микромицетов и охрана окружающей среды" /Киев,1986г./, симпозиуме "Эволюция фотобиологических процессов" /Пущино,1986г./; на специализированных научных семинарах в институте биохимии им.А.Н. Баха АН СССР, НИИЯФ МГУ, на каф. квантовой радиофизики физического факультета и каф. биофизики биологического факультета в Псковском университете.
Результаты исследований были также представлены в материалах 7-го ежегодного съезда американского общества фотобиологов /дскло-мар,Калифорния,США,1979г./, Междунар. симпозиума "Действие ультрафиолетовой радиации на растения" /Дели,Индия,1982г./, 1-го Европейского фотобиологического конгресса /Гренобль,Фцанция,1986г./ и Междунар. симпозиума "Активированные формы кислорода в биологических системах" /Варна,НРБ,1986г./
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 65 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 6 статей обзорного характера. Список основных работ приведен в конце автореферата.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, двух частей, включающих пять глав, о изложением и обсуждением экспериментального и литературного материала, заключения, основных выводов, приложения и списка цитированной литературы. Содержание работы представлено на 240 с. машинописного текста, иллюстрировано 80 рисунками и 12 таблицами; цитировано 280 литературных источников.