Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Активные формы кислорода, их роль и антиоксидантная защита клетки 6
1.1. Активные формы кислорода 6
Супероксид-анион радикал 9
Перекись водорода 10
Гидроксильный радикал 11
Оксид азота и пероксинитрит 13
Биологическая роль АФК 14
Повреждающая роль АФК 16
Антиоксидантная защита клетки 18
Глава 2. Образование 8-оксогуанина и его биологическая роль 21
Влияние различных экзогенных факторов на образование 8-оксогуанина в ДНК in vivo 24
Роль 8-оксогуанина в патогенезе и развитии различных заболеваний 25
2.3. Репарация 8-оксогуанина в ДНК 27
Глава 3. Влияние некоторых повреждающих факторов на ДНК 30
Ионизирующее излучение 30
Температурное воздействие 36
Ионы металов и обедненный уран 39
3.3.1. Обедненный уран 43
ЧАСТЬ И. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Глава 4. Материалы и методы исследования 47
Материалы 47
Методы 47
Определение концентрации ДНК 47
Облучение ДНК 48
Очистка моноклональных антител из асцитной жидкости 48
Образование 8-OG в ДНК под действием у-излучения 48
Иммуноферментный анализ 50
Определение тепловой продукции перекиси водорода в бидистиллированной воде и фосфатном буфере 51
Удаление продуктов окисления 8-оксогуанина ферментом 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой 52
Жидкостная колоночная хроматография 52
Определение тепловой продукции перекиси водорода в фосфатном буфере при действии уранилацетата и ацетата Na 53
Определение тепловой продукции ОН - радикалов в фосфатном буфере при действии уранилацетата и ацетата Na 53
Определение образования урацила в ДНК при действии тепла и ионов уранила 53
4.2.12. Депуринизация ДНК при действии тепла и ионов уранила 54
ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 5. Образование 8-оксогуанина в ДНК под действием физиологической
температуры 37С 55
Тепловое повреждение ДНК с образованием 8-оксогуанина при температуре 37С 55
Окисление 8-оксо-2'-дезоксигуанозина под действием тепла 58
5.3. Образование перекиси водорода при 37С 63
Глава 6. Дополнительное окисление 8-оксогуанина и образование продуктов его
окисления в ДНК 66
6.1. Выделение и идентификация продуктов дальнейшего окисления 8-оксогуанина при нагревании раствора ДНК после прогревания раствора ДНК
при80С 66
Глава 7. Действие на ДНК ионов уранила, у-излучения и тепла 77
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 91
ВЫВОДЫ 92
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ 93
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 94
Введение к работе
Одним из наиболее значимых повреждающих факторов среды действующих на биологические макромолекулы - нуклеиновые кислоты, белки и липиды, - являются активные формы кислорода (АФК). Такие формы кислорода индуцируются разнообразными причинами: ионизирующей радиацией, множеством химических мутагенов и канцерогенов, а также естественным и, особенно, нарушенным аэробным клеточным метаболизмом. Высокая реакционная способность АФК делает их чрезвычайно токсичными для биологических систем на всех уровнях - от молекулярно-клеточного до организменного. Одной из наиболее чувствительных и биологически важных мишеней при повреждении ДНК активными формами кислорода является гуанин, а продуктом повреждения 8-оксогуанин [Kasai et al., 1984]. Поскольку 8-оксогуанин (8-OG) является наибольшим по величине выхода продуктом, образуемым при действии АФК на нуклеиновые кислоты, то 8-OG в настоящее время считается одним из основных биомаркеров окислительного повреждения ДНК [Griffiths et al., 2002]. В отличие от других производных оснований, образованных под действием АФК, блокирующих репликационный процесс, 8-оксогуанин обладает неоднозначными субстратно-кодовыми свойствами при биосинтезе нуклеиновых кислот, что приводит к точковым мутациям трансверсионного типа G:C->A:T. О важности удаления 8-оксогуанина из организма говорит существование нескольких типов репарации этого повреждения у высших и у низших организмов. Действительно, в настоящее время установлена связь между образованием 8-OG и такими процессами как мутагенез [Брусков и др., 1992; Moria and Grollman, 1993], канцерогенез [Olinski et al., 2002], старение [Beckman and Ames, 1998] и патогенез болезней пожилого возраста [Зенков и др., 2001]. Поэтому исследование механизмов образования 8-оксогуанина в ДНК, при различных воздействиях, и его поведение в биологических процессах представляет актуальную фундаментальную проблему. Среди различных воздействий ведущих к генерации АФК и повреждению ДНК, ее спонтанной нестабильности, мутагенезу, старению и различным патологиям, роль тепла является наименее изученной. Из известных в настоящее время повреждений ДНК индуцируемых теплом (депуринизация, дезаминирование цитозина, однотяжевые разрывы сахаро-фосфатного остова), образование 8-оксогуанина установлено лишь недавно. Для понимания роли тепла необходимо вычленить и оценить ее относительную роль, как постоянно действующего физического фактора среды в повреждениях ДНК среди других воздействий. Необходимо также выяснить роль различных видов окислительных модификаций оснований ДНК в молекулярных механизмах индуцированного мутагенеза. Большую опасность для окружающей среды и здоровья человека (заболевания «неясной
этиологии», лейкемия и др.) представляет использование снарядов с обедненным ураном (ОУ) в ходе военных конфликтов. При взрывах таких снарядов происходит сгорание урана с образованием различных окислов. Среди них наибольшее биологическое действие, по-видимому, оказывают образующиеся ионы уранила [Miller et al., 2002; Yazzie et al., 2003]. Поскольку ОУ на 60% менее радиоактивен, чем природный уран, то он не может вызывать существенные генотоксические эффекты, связанные с радиационным воздействием. Поэтому причины такого действия ОУ на организм человека до сих пор являются неизвестными. Исследование молекулярных механизмов, приводящих к генерации АФК, образованию 8-оксогуанина и других повреждений оснований в ДНК под действием таких факторов среды, как тепло, у-излучение и ионы уранила, представляет собой актуальную фундаментальную проблему, связанную с необходимым пониманием процессов мутагенеза, канцерогенеза и старения, индуцированных действием этих факторов окружающей среды.
Целями диссертационной работы являлись:
изучить процесс теплового повреждения ДНК in vitro с образованием 8-оксогуанина, продуктов его дальнейшего окисления;
исследовать модифицирующее влияние ионов уранила на образование 8-оксогуанина в ДНК под действием тепла и у-излучения.
В соответствии с выбранными целями были поставлены основные задачи:
исследовать процесс окисления гуанина в ДНК in vitro с образованием 8-OG и возможность его дальнейшего окисления при физиологической температуре 37С;
выделить и идентифицировать продукты дальнейшего окисления 8-OG;
исследовать возможность влияния ионов уранила на генерацию активных форм кислорода под действием тепла, возможность усиления продукции 8-OG и других повреждений оснований в ДНК in vitro под действием тепла и у-излучения.
ЧАСТЬ I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
