Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
Среди фундаментальных проблем, общих для биофизики, клеточной биологии и медицины, важное место занимает проблема развития опухолевого процесса и изучение механизмов его регуляции. До настоящего времени проблема рака продолжает оставаться одной из наиболее актуальных и сложных в современной науке, что обусловлено стабильно высоким уровнем онкологической заболеваемости и часто неудовлетворительными результатами ее лечения. Механизмы взаимодействия опухоль - организм по праву считаются основополагающими в развитии опухолевого процесса, его системном влиянии, индуцирующим расстройство гомеостаза (прежде всего, как результат успешной. конкуренции опухоли с тканями организма за жизненно важные метаболиты, витамины, антиоксиданты). В результате такой конкуренции, формируется стабильный дисбаланс между развивающейся опухолью и организмом, при котором именно опухолевые клетки приобретают более благоприятные условия для своего роста и повышенную устойчивость к повреждениям. Действительно, для большинства опухолевых клеток и их мембранных фракций характерен более низкий уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в сравнении с нормальными клетками. Наиболее вероятным субстратом ПОЛ в организме являются полиненасыщенные жирные-, кислоты (ЖК). Известно, что многие опухолевые клетки содержат липопротеиновые гранулы с высоким уровнем содержания -полиненасыщенных ЖК, в частности линолевой и арахидоновой ЖК. Неясно какие механизмы при этом позволяют опухолевым клеткам поддерживать высокую устойчивость к образованию продуктов ПОЛ, особенно когда количество и объем таких гранул в клетках возрастает. В 1969 году Dormandy T.L. выдвинул теоретическое предположение, что если полиненасыщенные ЖК (ПНЖК) преимущественно входят в состав мембранных структур, то в таких клетках следует ожидать снижение устойчивости к ПОЛ-индуцированным летальным повреждениям. Напротив, преимущественная аккумуляция связанных ПНЖК в составе внутриклеточных липид-содержащих гранул способна защитить клетки, так как такие гранулы могут работать как ловушки свободных радикалов (СР), снижая доступность
высокореактивных окислителей к мембранным структурам (основных индукторов апоптоза и некроза). Таким образом, характер внутриклеточного распределения ПНЖК может существенно влиять на устойчивость клеток к окислительным повреждениям. Теоретическое предположение Dormandy T.L. ранее не проверялась, вероятно, из-за отсутствия прямого метода, который бы позволил непосредственно измерить устойчивость к окислительному стрессу в одиночных, живых клетках и их внутриклеточных компартментах (в частности, в кластерах из опухолевых липопротеиновых гранул и в участках цитоплазмы, не содержащих эти гранулы).
Проблема взаимодействия опухоль-организм является основополагающей в прогрессии опухолевого процесса, его опосредованном, негативном действии на организм хозяина. Такое действие опухоли индуцирует каскад неспецифических нарушений функций различных органов и систем, непосредственно не связанных с локализацией первичной опухоли. Одним из проявлений негативного действия опухоли на организм опухоленосителя является увеличение содержания продуктов ПОЛ, появление некоторых модифицированных белков с большей устойчивостью к деструкции (как например, фибрин). Не изучено, принимают ли такие модифицированные белки участие в развитии комплекса вторичных болезней опухоленосителя, мало-зависящих от локализации первичной опухоли и известных также под названием "Паранеопластический синдром". Проведение таких исследований представлялось важным, так как именно вторичные болезни часто являются непосредственной причиной смерти опухоленосителя. К числу таких болезней, прежде всего, следует отнести нарастающую эндотоксикацию опухоленосителя (эндоток-семия), которая развивается на фоне приобретенной гиперчувствительности организма к летальному действию эндотоксинов (в частности, к фактору некроза опухоли). Усиливаются также симптомы необратимой анемии и гиперферритинемии, сопровождающиеся массивными отложениями водонерастворимого ферритина в селезенке, хотя обычно ферритин является водорастворимым белком. В серии опытов in vitro O'Connel M.J. показал, что водорастворимый ферритин становится водонерастворимым
после модификации его структуры свободными радикалами (СР). Такой СР-модифицированный ферритин становится устойчивым к протеолизу и приобретает характерную желто-оранжевую флуоресценцию (сходную с флуоресцентцией гемосидерина и липофусцина, известных пигментов старения). К моменту начала данной работы не было известно является ли ферритин, накапливающийся в селезенке опухоленосителя СР-модифицированным, и если да, то кореллирует ли его появление с уменьшением порога устойчивости спленоцитов к окислительному стрессу, и на какой стадии взаимодействия опухоль-организм это происходит.
Целью настоящей работы явилось выяснение механизмов, способствующих сохранению высокой резистентности опухолевых клеток к окислительному стрессу и потере такой устойчивости в нормальных клетках опухоленосителя, а также исследованию данного дисбаланса как возможной патофизиологической основы для развития ряда вторичных болезней опухоленосителя (в частности, перекисной интоксикации, селезеночной гиперферритинемии, гипохромной анемии, обусловленной крайне низкой реутилизацией ионов железа из ферритинового депо).
Цель исследования обусловила постановку ряда задач:
-
Выбор экспериментальных моделей развития опухолей, различающихся по уровню содержания внутриклеточных липопротеиновых (ЛП) гранул.
-
Поиск и разработка методов, позволяющих с максимальной контрастностью визуализировать ЛП-гранулы в нативных опухолевых клетках и количественно оценивать порог устойчивости к развитию перекисного стресса как в нативных тканях и отдельных живых клетках, так и различных внутриклеточных компартментах, содержащих и несодер-жащих ЛП-гранулы.
-
Изучение действия опухоли на организм, путем сравнения динамики порога устойчивости опухолевых и нормальных клеток к окислительному стрессу на разных стадиях развития опухолевого процесса.
4. Исследование возможности эндогенной генерации
свободных радикалов самими опухолевыми клетками (прежде
всего, на стадии быстрого поступления нормоксической
плазмы к гипоксическим асцитным опухолевым клеткам, т.е.
в состоянии имитирующем переход гипоксия-реперфузия in
vivo). Изучить цитохимическим методом, в каких именно
внутриклеточных компартментах могут генерироваться окси-
данты и какие это может иметь последствия для выживания
опухолевых клеток.
-
Изучение влияния опухоли на организм, по возникновению вторичной болезни накопления - селезеночной гиперферри-тинемии, развитие которой сопровождается накоплением водонерастворимого ферритина с высокой устойчивостью к деструкции и сравнение спектральных свойств этого селезеночного ферритина и ферритина, модифицированного свободными радикалами in vitro.
-
Оценка возможности использования перфторорганических соединений как сорбирующих агентов, способных удалять гидрофобные продукты окислительного стресса из организма опухоленосителя. Разработка метода, позволяющего наблюдать за поведением перфторорганических соединений в живых тканях.
Открыты пространственно-упорядоченные кластерные структуры из ЛП-гранул в живых клетках асцитной гепатомы Зайделя (АГЗ). Это стало возможным благодаря применению интерференционной микроскопии с полным расщепленным изображением, используемой с целью визуализации единичных липидсодержащих гранул с максимальным цветовым контрастом, что позволило впервые выявить треугольно-подобные кластеры из этих гранул в делящихся, одиночных клетках АГЗ, где они симметрично распределены относительно линии межклеточного раздела. Были выявлены также приповерхностные "кэпообразные" кластеры из ЛП-гранул в опухолевых клетках АГЗ и АОЭ.
Впервые получены прямые экспериментальные подтверждения гипотезы Dormandy T.L. о потенциальной способности внутриклеточных липопротеинов улавливать свободные радикалы. Показано особое значение этого механизма для защиты асцитных опухолевых клеток в период
развития "Паранеопластического синдрома" в организме опухоленосителя. Проведение таких прямых измерений стало возможным благодаря нашим разработкам в создании нового метода, позволяющего измерить устойчивость к окислительному стрессу непосредственно в одиночных опухолевых клетках или их липопротеиновых кластерах (или в участках цитоплазмы без липопротеинов). Выявлены также метаболические условия, при которых опухолевые внутриклеточные липопротеины приобретают способность работать ловушками свободных радикалов.
Впервые, и только в селезенке опухоленосителя с гиперферритинемией, зарегистрировано появление желто-оранжевой флуоресценции с высокой устойчивостью к процессам деструкции (подобные свойства приобретает ферритин после его модификации свободными радикалам in vitro. Накопление СР-модифицированного ферритина в селезенке опухоленосителя коррелировало с потерей потенциальной устойчивости спленоцитов к окислительному стрессу, возникновению эндогенных источников генерации оксидантов. Эти изменения непосредственно предшествовали развитию симптомов эндотоксического шока и анемии. Предложен механизм объясняющий взаимосвязь этих эффектов. Предполагается, возникновение нового "порочного" цикла, в котором из-за необратимой модификации ферритина, реутилизация ионов железа значительно снижена. В результате блокируется рост опухоли, на фоне прогрессии анемии и эндотоксемии организма-хозяина.
Впервые экспериментально установлено, что химически инертные перфторорганические (ПФО) соединения обладают биологической активностью, проявляющейся в сорбции белков, липидов, клеток с повышенной гидрофобностью. Визуализация этих сорбционных эффектов стала возможной благодаря нашим разработкам первого в мире прямого метода, позволившего однозначно идентифицировать ПФО-соединения в нативных цитологических препаратах. В последние годы ПФО-соединения успешно применяются в зарубежной онкологической практике (как газо-транспортирующие среды, усиливающие цитотоксич-ность противоопухолевых воздействий). На основании наших данных можно считать, что такая эффективность
основана не только на известных газо-транспортирующих свойствах ПФО-соединений, но и на их способности сорбировать токсичные, гидрофобные соединения, возникающие в результате развития окислительного стресса в организме опухоленосителя.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ
-
Предложен механизм системного действия опухоли, способствующий развитию комплекса вторичных болезней, часто являющихся непосредственно причиной смерти опухоленосителя. Этот механизм базируется на способности злокачественных опухолей индуцировать развитие окислительного стресса в некоторых тканях опухоленосителя при сохранении самими опухолевыми клетками высокой резистентности к повреждающему действию свободных радикалов. Развитие такого дисбаланса индуцирует приобретение ряда обратимых и необратимых модификаций некоторыми жизненно важными белками, в частности ферритином. В итоге в селезенке развивается новая, вторичная болезнь накопления модифицированного ферритина (с низкой способностью к реутилизации ионов железа), что в свою очередь усиливает анемию опухоленосителя, делает ее стабильной и необратимой. Важным практическим следствием формирования этого нового "порочного цикла" является противопоказание к применению экзогенных препаратов железа для нормализации этого типа анемии. Предложенный механизм экспериментально обоснован и имеет большое научно-практическое значение, так как позволяет выработать стратегию возможных превентивных действий, лимитирующих негативное влияние опухоли на окислительную устойчивость организма.
-
Разработанный экспресс-метод определения порога устойчивости в тканевых препаратах (а также в одиночных, живых клетках и их внутриклеточных компартментах) к окислительному стрессу, впервые дает возможность оперативно оценить системное действие опухоли на организм хозяина. Этот метод имеет хорошую перспективу найти применение в самых различных областях экспериментальной биологии и клинической медицины.
3. Приведенные в работе данные о способности некоторых
внутриклеточных липопротеинов работать ловушками
свободных радикалов и защищать опухолевые клетки от летальных повреждений, необходимо учитывать при оценке опухолевой резистентности и выборе противоопухолевой терапии (особенно на поздних стадиях развития опухолевого процесса).
4. Используемый в работе метод интерференционной микроскопии с полным расщепленным изображением в качестве способа визуализации одиночных внутриклеточных липо-протеинов и их структур может оказаться крайне полезным для решения различных задач липидологии живой клетки (в частности, для изучения механизмов формирования пространственно-упорядоченных структур из опухолевых ЛП-гранул). Этот редко используемый метод, оказался также незаменимым для прямой цитовизуализации перфтор-органических соединений и установления факта их сорбционной активности. Накопленный опыт применения этого метода может быть полезным для практического применения перфторорганических соединений в трансплантологии, локальной перфузии органов, создании новых оксигенирующих систем.
Результаты работы были представлены на 5 Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию физиологически активных веществ, г.Рига, 1983; 2 Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение", г.Рига, 1985; 6 Конференции онкологов Прибалтийских республик, г.Рига, 1985; 4 Всесоюзном симпозиуме "Регуляция иммунного гомеостаза", г.Ленинград, 1986; 1 Всесоюзном рабочем совещании "Биофизика рака", Черноголовка, 1987; 5 Всесоюзный съезд геронтологов и гериатров, г.Тбилиси, 1988; 4 Всесоюзный съезд патофизиологов, г.Кишенев, 1989; International conference "Regulation of free radical reactions", ^/arna, Bulgaria 1989; 5 Всесоюзном симпозиуме "Взаимодействие нервной и иммунной системы", -.Ленинград, 1990; Всесоюзном симпозиуме "Биохимия эпухолевой клетки", г.Минск, 1990; 2-th Meeting the -ederation of Europ. Biochem. Soc, Hungary, 1990; 4-th nternational Symposium of Lipofuscin and Ceroid Pigments "'Biology of Aging-92"), Tampere, Finland, 1992; 25-th Annual
Meeting of the European Society for Radiation Biology, Stokholm, Sweeden, 1993; International Congress of "Cell Biology", Praque, Czechoslovakia, 1994; 5-th International Symposium of Lipofuschin, "Gerontology Week in Japan", Tokyo, Japan, 1995; Keystone Symposium "Oxidant Stress: From Molecules to Man", USA, 1996; International Symposium "Anticancer Target and Strategies for the Twenty-First Century", Castres, France, 1996; 1 Международный Симпозиум "Фундаментальные науки и альтернативная медицина", г.Пущино, 1997.
МЕТОДЫ
РАЗРАБОТКА И ОПТИМИЗАЦИЯ КОМПЛЕКСА МЕТОДОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ НАТИВНЫХ ТКАНЕЙ, А ТАКЖЕ ЕДИНИЧНЫХ, НАТИВНЫХ КЛЕТОК И ИХ ЛИПОПРОТЕИНОВ К ОКИСЛИТЕЛЬНОМУ СТРЕССУ Генерация прооксидантов, является обязательным атрибутом нормальной аэробной жизни. Постоянное образование прооксидантов в живых организмах уравновешенно той же скоростью их дезактивации антиоксидантами, что требует непрерывной регенерации антиоксидантного потенциала клетки. Развитие конституционного дисбаланса между оксидантами и антиоксидантами, прежде всего отражается на изменении порога устойчивости клеток к экзогенному окислительному стрессу. Резистентность клеток - интегральный показатель, в немалой степени зависящий от химического состава клеточных липидов, их структурной организации, а также от уровня экспресии ряда важных защитных белков (Bcl-2, хит-шоковских белков). Обычно для тестирования потенциальной клеточной устойчивости к окислительному стрессу используются свободные радикалы, генерируемые в модельных системах (в частности, ксантиноксидазной реакции) и непосредственно действующие на суспензию изучаемых клеток или препаративно выделенных субклеточных фракций. В итоге измеряется суммарный уровень образования конечных продуктов окисления (в частности,.малонового диальдегида) с помощью биохимических методов. Такие методы определения клеточной устойчивости давно и широко применяются, но они не позволяют производить прямые измерения резистентности в одиночных клетках, и тем более в их внутриклеточных компартментах.
Нам удалось разработать микроспектрофлуо-ресцентный экспресс-метод, который впервые позволяет оценить резистентность нативной ткани, а также индивидуальных клеток и их внутриклеточных органелл к окислительному стрессу. В этом методе УФ-свет (Я.=365нм) использовался как экзогенный индуктор генерации радикалов, в изучаемых внутриклеточных компартментах, где затем измерялся уровень образовавшихся флуоресцентных продуктов (ФП) перекисного окисления липидов (ФП-ПОЛ) в спектральной полосе 430-470нм.
Рис.1. Скорость уменьшения интенсивности (I) флуоресценции (УФ-фотодеструкция), тестируемая при 1=460нм для НАД(Ф)Н (а), линоленовой (D) и линолевой (А) жирных кислот, а также смеси полиненасыщенных жирных кислот (V) при непрерывном действии УФ-света (А); Реакция УФ-фотодеструкции линолевой кислоты (В) развивается как при действии УФ-света, /\.=365нм (заштрихованные участки), так и в темновых условиях (не заштрихованные участки) после инициирующего действия УФ-света. Стрелки вниз - указывают на момент выключения УФ-света, стрелки вверх - на его включение (аналогичные обозначения и на Рис.2).
'460 и .уф . свет
D - темновые условия
— 5 mm и более —I Время(МИН)
Рис.2. Схема демонстрирует принцип спектрокинетической идентификации и разделения в условиях нативной клетки двух важных соединений, флуоресцирующих в одной, общей спектральной полосе (430-470нм). К ним относятся: 1) флуоресцирующие продукты перекисного окисления липидов (ФП-ПОЛ), характеризующиеся высокой скоростью УФ-фотодеструкции [эта реакция продолжается и в темновых условиях (точка 2 ниже точки 1)]; 2) НАД(Ф)Н, флуоресценция которых более устойчива к фотодеструктивному действию УФ-света (^=365нм), более того, живая клетка способна регенерировать интенсивность НАД(Ф)Н флуоресценции в темновых условиях (точка 4 выше точки 3, точка 6 выше точки 5). Применение набора микродиафрагм [с различным диаметром] позволяет использовать УФ-свет как экзогенный локальный индуктор свободных радикалов, с целью последующего определения [по уровню ФП-ПОЛ] порога устойчивости различных внутриклеточных компартментов или одиночных клеток к пероксидативному стрессу. Перечисленные выше спектро-кинетические различия между флуоресценцией НАД(Ф)Н и ФП-ПОЛ были нами использованы, чтобы в условиях одиночной живой клетки четко отличить их друг от друга, а затем оценить их вклад в общую интенсивность полосы флуоресценции с максимумом Х=460нм (условно принятого за 100%).
В этой же спектральной полосе одновременно флуоресцирует и НАД(Ф)Н, который однако отличаются от ФП-ПОЛ большей устойчивостью к УФ-фотодеструкции (Рис.1 А), а также тем, что в условиях нативной клетки интенсивность флуоресценции НАД(Ф)Н может быть частично восстановлена в темновых условиях (Рис.2). Напротив, ФП-ПОЛ характеризуются УФ-фотодеструкцией, которая способна продолжаться и при действии УФ-света, и в темновых условиях [это свойство ФП-ПОЛ наблюдается как "в модельной системе (Рис.1 В), так и в условиях живой клетки (Рис.2)].
Для проверки гипотезы Dormandy [о предполагаемой способности внутриклеточных ЛП-гранул работать ловушками свободных радикалов], необходимо было визуализировать ЛП-гранулы именно в нативных опухолевых клетках, а затем измерить в них устойчивость к окислению. С этой целью микроскопирование проводилось с применением метода интерференционного контраста с полным расщепленным изображением. Этот редко применяемый метод наиболее адекватен для изучения чисто фазовых объектов - не поглощающих свет, но вносящих изменения в фазу проходящего через него излучения (именно такими объектами являются опухолевые клетки и их липопротеины). В свою очередь эта разность фаз равна произведению показателя преломления света (п) на путь, пройденный светом -толщину. Разность между показателем преломления цитоплазмы (1,36) и показателем преломления опухолевых липопро-теинов (1,5), которые в основном состоят из жидких липидов, настолько существенна, что цвет гранул в интерференционном изображении резко отличается от цвета, окружающей их цитоплазмы (Рис. 3,4). Это позволяет более точно измерить диаметр этих гранул, изучить особенности их внутриклеточного распределения.
Этот метод также оказался незаменимым для прямой визуализации химически инертных ПФО-соединений, для которых характерен аномальный показатель преломления (ниже единицы), тогда как у всех биологических объектах этот показатель выше единицы. Это свойство послужило основанием для создания метода визуализации ПФО-соединения в любых нативных цитологических препаратах с целью проверки их сорбционной активности.
В
Рис.3.
Рис.4.
Рис.3. Визуализация липопротеиновых (ЛП) фанул в асцитных опухолевых клетках АГЗ [интерференционная микроскопия, метод "Интерфако" с полным расщепленным изображением ЛП-гранул].
А,Б - многоклеточные агрегаты из суспензии опухолевых клеток АГЗ на 2-ые (А) и 5-ые сутки (Б) развития опухолевого процесса in vivo.. По мере роста опухоли, с увеличением числа ЛП-гранул увеличивается из размер, а также возможность появления ЛП-гранул на периферии опухолевых клеток и за ее пределами (Б);
В,Г - топография распределения и пространственная упаковка ЛП-гранул в делящихся нативных АГЗ-клетках - [В -интерференционное микроскопировании; Г - та же клетка после фиксации и окраски акридиновым оранжевым (люминесцентное микроскопирование)]. На фотографии четко видна симметричность в распределении треугольньгх кластеров из ЛП-гранул относительно линии межклеточного раздела и линии, мысленно соединяющей два ядра (В). После фиксации кластеры из ЛП-гранул выявляются в виде неприкрашенных темных пятен, пространственная упаковка ЛП-гранул в кластеры не видна (Г).
Рис.4. Одиночные опухолевые клетки из нативной суспензии асцитной гепатомы Зайделя: А - "Кэпообразные" кластеры из ЛП-гранул, расположенные на периферии АГЗ-клетки, а возможно, и на ее поверхности; Б - явление сферуляции и клазматоза, в результате которых ЛП-гранулы образуют плотно-упакованные агрегаты в составе некоторых везикул, способных к последующему отрыву от клеточное поверхности и появлению во внеклеточное среде.
Для цитохимической визуализации внутриклеточных мест с супероксидной генерацией радикалов была использована способность этих радикалов восстанавливать витальный, водорастворимый краситель (пара-нитро-тетразолий фиолетовый) до нерастворимого формазана. В работе использовалось несколько режимов и условий окраски, что позволило отличить высокореакционный места окраски от неспецифических, низкореакционных.
В работе использовался потенциал-чувствительный витальный краситель родамин-123, по интенсивности флуоресценции которого можно было оценить энергетическое состояние митохондрий в опухолевых клетках.
Белок-синтетическая активность клеток тестировалась на фиксированных клеточных препаратах по их цитохимической окраске акридиновым оранжевым (Rigler R.,1966) и последующем цитофлуоресцентном микроскопировании.
Активность супероксиддисмутазы и глутатион перок-сидазы -в опухолевых клетках определяласть по методу Blaachmp С, Fredovich J (1971) & Paylia D.E. (1967). Уровень общих липидов и соотношение в них ненасыщенных жирных кислот к насыщенным определялось газово-хроматографи-чески (Gerson Т., 1966). Комплекс этих измерений был выполнен профессором В.З. .Панкиным, в рамках серии совместных исследований (23,24).