Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние пятнадцать лет молекулярная генетика переживает настоящий польем. В его основе лежит "промышленная революция" в методах Исследования и работы с ДНК. Решение ряда новых задач, возникающих при ееквенировании генома человека, требует разработки принципиально новых подходов при манипулировании с ДНК. Среди них: получение еысокоспецифичннх редкощепящих рестриктаэ, физическое картирование, очистка и выделение длинных ДНК фрагментов, разработка новых агентов для химической генотерапии.
С 1970 года, года открытия В. Арбером фериентов-рестриктаз, было найдено и налажено серийное производство огромного количества ферментов этого типа. В настоящее время работа ни одной молекулярно-генетической лаборатории уже просто не мыслится без использования рестриктаэ. Однако все эти природные ферменты обладают сравнительно небольшими сайтами узнавания. Сайт рестрикции рестриктаэ ті типа, как правило, симметричный палиндром длиной от 4 до 0 пар нуклеотидов. Если считать последовательность ДНК случайной, то ясно, что рестриктаза специфичная к восьми парам оснований будет вносить один разрыв в среднем на 4e=65.5 kbp. Очевидно, что при разрезании хромосомной ДНК возникнет большое количество фрагментов приблизительно одинаковой длины и это сильно затруднит их идентификацию. Таким образом, для ряда задач (например, для секвенирования генома человека) были бы очень полезны искусственные редкощепящие рестриктазы. Поскольку создание такого фермента на основе узнавания ДНК-белок в настоящее время выглядит крайне затруднительным, то наиболее вероятным кандидатом на эту роль представляется модифицированный олигонуклеотид. Узнавание в этом случае достигалось бы образованием специфичного комплекса, а разрезание- за счет реакционной группировки, пришитой к олигонуклеотиду, либо с использованием методики "ахилессовоП пяты". На этом пути возникает целый комплекс проблем: эффективность разрезания, .качество разрывов и специфичность узнавания. Решение вопроса специфичности, в свою очередь, невозможно без определения термодинамических и кинетических параметров.
Традиционные методы разделения и очистки ДНК лишь частично применимы для длинных двунитепнх хромосомных ДНК.
Высокоспецифмчное узнавание ДНК с помощью олигонуклеотидов и здесь могло бы сыграть решающую роль.
Электронномикроскопическое картирование с помощью специфических комплексов олигонуклеотид- дуплексная ЛНК является хорошей альтернативой современных методов физического картирования.
В настоящее время широко обсуждается использование олигонуклеотидного узнавания для химической генотерапии. Ясно, что для этого необходимо получить модифицированный олигонуклеотид, который проникал бы в клетку, был устойчив к действию нуклеаз и образовывал бы стабильный комплекс при физиологических условиях. Это позволило бы выклпчать нежелательные гены (например, онкогены), блокировать развитие вирусов.
Итак, олигонуклеотидное узнавание двунитепоп ЛНК является на сегодняшний день одной из самых актуальных и перспективных тем в физической химии нуклеиновых кислот.
Цель настояаей работы заключается в изучении свойств межмолекулярных пиримйдин-пурин-иурннрвых триплексов, разработке методов УФ фотофутпринтинга триплексов с детекцией" Мислоаутановых фотодимеров и электронномикроскопической визуализации тройных комплексов.
Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе ьпервые были найдены универсальные условия образования межмолекулярных пиримидин-пурин-пуриновых триплексов при физиологических рН; показано, что время жизни таких тройных спиралей довольно ' велико, по крайней мере, больше нескольких часов; исследовано влияние разных типов триплексов на выход циклобутановых димеров, то есть, детально отработан вариант метода УФ фотбфутпринтинга, который может' быть применен для исследования триплексов как in vixro^ так и- 'о vivo-; обнаружен новый тип "тройных спиралей- проТонированныЙ пиримидин-пурин-пуриновый трлплек'с; разработан универсальный метод электронно- микроскопической визуализации тройных комплексов между олигонуклеотидом и плаэмидной ДНК. Практически одновременно с другими авторами' было показано, что пиримидин-пурин-чуриновые триплексн имеют лишь антипараллельную полярность нитей (по отношению к пуриновой нити дуплекса). Также была открыта новая неканоническая структура из семейства И форм,
содержащая протонированішй пиримидин-пурин-пуриновый триплекс. Апробация. Материалы работы докладывались на международных Конференциях "Synthetic Oligonucleotides: Problems алсі Frontiers оГ Practical Application", Москва (Июнь 1991 г.); "7th Conversations on Hiomolecul ar Stereodynamics", Albany (ИЮНЬ
1ЭЯ1Г.); Второй Всесоюзной Конференции "Геном Человека-ЗІ", Переславль-ЯалеоскиП (Октябрь 1991г.); "DNA Structure and Protein Пім'иц'пі і ion", Mndriii (Март 1992г.); студенчоских конференциях МФТИ 1990г., 1991г., 1992г.; а также на семинарах Отдела Экспрессии Генома ИМГ РАН.
Публикации. Ни теме диссертации имоется 7 публикаций и еще 3 статьи посланы в печать.
Материалы и мстиды. В данной работе был использован целый ряд различных подходов. Среди них: коммграция меченных олнгонуклеотидов с плазмидной ДНК при гель-электрофорезе, фотофутнрннтинг с регистрацией 16-41 и циклобутановых фотоднмеров, химическое зондирование и другие.