Введение к работе
1.1 Актуальность исследования. Начиная с первых работ, в которых было установлено, что инкубируемые in vitro срезы мозговой ткани взрослых теплокровных животных обладают метаболической активностью (Warburg et al, 1924, Mcllwain, 1951), сохраняют потенциал покоя (Li, Mcllwain, 1957) и синаптические ответы нейронов (Yamamoto, Mcllwain, 1966), эти препараты стали широко использоваться для решения фундаментальных и прикладных задач нейробиологии и медицины. Применимость метода для широкого спектра исследований связана с сочетанием возможностей, присущих исследованиям интактного мозга и методам культивирования нервной ткани. Однако, существенным недостатком метода является ограниченный период стабильного состояния инкубируемой in vitro ткани мозга взрослых животных (в пределах нескольких часов).
В связи с этим представляется актуальным исследование изолированных препаратов мозга взрослых гибернирующнх животных, ткани которых обладают чрезвычайно высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям среды в период зимней спячки. Сохранность функций ЦНС у габернирующих животных после глубокого охлаждения в природных условиях (до 0 С и иногда ниже) свидетельствует о том, что нейроны при этом должны как минимум сохранять способность к электрогенезу после согревания. Можно полагать, что инкубируемые in vitro препараты мозга зимнеспящих обладают особыми свойствами, обеспечивающими их высокую резистентность к условиям глубокой гипотермии. Однако, исследования в этом направлении почти отсутствуют за исключением работ J.M.Horowitz et al. (1986, 1989, 1993), посвященных изучению температурных порогов электрогенеза в срезах гиппокампа зимнеспящих животных.
Следует отметить, что в условиях in vivo крайне трудно детально исследовать активность мозга зимнеспящих, не внося нарушений в естественный ход гибериации. Поэтому важным направлением изучения гибернации представляется анализ нейронной активности различных
структур мозга после изоляции их из организма зимнеспящих животных в период оцепенения и бодрствования для выявления состояние-зависимых изменений.
1.2. Цель и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы является изучение особенностей функционирования in vitro препаратов лимбических структур мозга, активно участвующих в регуляции циклов зимней спячки, для анализа механизмов нервного контроля гибернации, определения параметров функциональной устойчивости изолированной ткани мозга зимнеспящих и поиска путей повышения стабильности in vitro препаратов гомеотермов. Основные задачи исследования;
1. Провести сравнительный анализ нейронной активности in vitro
препаратов, изолированных из отделов мозга, активно участвующих в
регуляции циклов гибернация-эутермия, трех групп животных
(гибернирующих, бодрствующих сусликов и морских свинок).
2. Сопоставить результаты исследования нейронной активности in vitro с
существующими данными in vivo для теоретического анализа
полученного материала.
-
Провести сравнительное исследование резистентности к посттравматическому шоку и длительной инкубации in vitro при периодическом воздействии гипотермии срезов мозга трех указанных выше экспериментальных групп животных.
-
Провести поиск и исследование новых подходов к увеличению выживаемости и резистентности к гипотермии in vitro препаратов гомеотермных животных.
1.3. Научная новизна исследования:
Впервые изучены характеристики нейронной активности in vitro препаратов мозга зимнеспящих животных в различных функциональных состояниях и на основании этого дополнены существующие представления об участии структур лимбической системы мозга зимнеспящих в контроле циклов гибернация-эутермия.
Впервые показана высокая резистентность препаратов мозга зимнеспящих сусликов к условиям длительной инкубации при периодическом воздействии глубокой гипотермии, что расширяет спектр исследовательских задач нейрофизиологии и биофизики с применением in vitro препаратов. Устойчивость ткани мозга зимнеспящих позволила разработать метод инкубирования in vitro изолированного препарата головного мозга гибернирующего суслика.
Разработаны оригинальные критерии и методы оценки функциональной устойчивости препаратов мозга зимнеспящих и гомеотермных животных.
Предложен и исследован новый метод, позволяющий за счет ингибирования циклооксигеназной активности на стадии приготовления резко сократить период электрического "молчания" нейронов в срезах гиппокампа гомеотермных животных (морские свинки) после травматического шока и радикально увеличить их резистентность к длительной инкубации при периодическом воздействии гипотермии.
1.4. Теоретическая и практическая значимость. Сопоставление результатов диссертационной работы, полученных в in vitro исследованиях с литературными данными позволило дополнить существующие представления об участии структур лимбической системы в регуляции циклов зимней спячки млекопитающих. Изучение динамики активности нейронов в переходные периоды сразу после приготовления срезов, действия гипотермии, и в течение длительной инкубации дало возможность получить большой объем новых данных о резистентности ткани мозга зимнеспящих к неблагоприятным условиям, что необходимо для анализа механизмов устойчивости нервной ткани животных и человека. Способность к электрогенезу in vitro препаратов дифференцированной ткани мозга взрослых сусликов в течение нескольких суток в достаточно простой среде инкубации позволяет решать фундаментальные нейробиологические и биофизические задачи в длительных экспериментах с их применением, что невозможно в
исследованиях на срезах мозга гомеотермных лабораторных животных. В частности, в работе показано, что срезы гиппокампа суслика способны к индукции долговременной потенциации даже на 4-е, 5-е сутки после изоляции, тогда как известно, что исследование этого феномена (модель долговременной памяти нейронных сетей мозга) ограничивается несколькими часами при работе на срезах крыс или морских свинок.
Теоретическое и практическое значение имеет показанная в работе возможность существенного повышения устойчивости срезов мозга гомеотермных животных (морские свинки) при обработке их ингибиторами циклооксигеназной активности на стадии резки ткани. Значение и новизна предложенного подхода состоит в том, что до сих пор не найдено удовлетворительных способов поддержания жизнеспособности срезов гомеотермов на достаточно высоком уровне, при котором генерация нейронной активности могла бы сохраняться более 24 часов (особенно популяционных ответов). Факт ограниченности периода стабильного функционирования срезов мозга был особо отмечен в итоговой дискуссии на симпозиуме, посвященном этим методам (США, Луисвилл, 1994). Полученные результаты имеют также теоретическую и практическую значимость в медицине для разработки методов лечения мозговых травм, нейрологических расстройств различной этиологии, инсультов и ишемических нарушений, а также для консервации органов и тканей.
1.5. Основные положения, выносимые ва защиту:
1. Обоснование положения об участии лимбических структур мозга
зимнеспящих в регуляции циклов гибернация-эутермия по результатам
впервые проведенных исследований особенностей нейронной активности
срезов мозга зимнеспящих и гомеотермов в сопоставлении с данными in
vivo.
2. Положение о высокой функциональной устойчивости препаратов мозга
зимнеспящих к травматическому шоку, гипотермии и длительной
инкубации in vitro (по критериям электрогенеза) в сравнении с
препаратами мозга гомеотермов.
3. Новый подход к повышению функциональной стабильности срезов гиппокампа гомеотермов (морских свинок) путем ингибирования циклооксигеназной активности на стадии приготовления. 1.6. Апробация работы и публикации. Результаты исследований, вошедшие в диссертацию, представлялись на:
семинарах Лаборатории системной организации нейронов ИБФ АН СССР и лаборатории природных гипометаболических состояний ИБК РАН
заседаниях Путинского отделения Физиологического общества
рабочих совещаниях «Моделирование и методы анализа биоэлектрической активности головного мозга», 1982, 1984, г. Пущино
Всесоюзном физиологическом съезде, 1984, г. Кишинев
Всесоюзном симпозиуме «Нейрон in vitro», г. Пущино, 1986
межлабораторном семинаре института ВНД и нейрофизиологии, 1986
Всесоюзной конференции, посвященной 80-летию чл.-корр. АН и АПН СССР Л.Г.Воронина, 1988, МГУ, г.Москва
Всесоюзном симпозиуме «Механизмы природных гипометаболических состояний», 1989, г.Пущино
международном симпозиуме "Living in the cold III", Colorado, 1993, США
международной конференции «Annual Neuroscience Meeting», 1993, Boston, США.
научной конференции ИБК РАН, 1996
международной конференции IBRO, Newcastle, 1996, Англия
Ш-й международной конференции стран СНГ по функциональной нейроморфологии "Колосовскиечтения-97",г.Санкт-Петербург, 1997
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 29
работ, в том числе обзор по заказу главного редактора в журнале
«Progress in Neurobiology». ^
Объем и структура работы. Диссертация изложена на а№ ^ страницах и состоит из «Введения», «Литературного обзора», «Основных методов и экспериментальных разработок», четырех глав описания результатов экспериментов, «Обсуждения результатов» и «Выводов». Работа содержит 7 таблиц и 42 рисунка. Список цитируемой литературы приводится в конце диссертации, содержит 58 отечественных и 420 иностранных источников.