Введение к работе
Актуальность проблемы. Клетки одноклеточных организмов постоянно находятся в контакте с окружающей средой и непосредственно подвержены действию ее изменяющихся физико - химических факторов. Следовательно, они должны обладать мощными системами контроля, обеспечивающими их быстрый рост в благоприятных условиях и эффективное выживание в неблагоприятных. Для оптимального жизнеобеспечения клетки система синтеза ключевых макромолекул должна поддерживаться в стабильном и строго сбалансированном состоянии, поэтому необходимо наличие множественных регуляторных систем, чувствительных к изменяющимся факторам и оперативно обеспечивающих экспрессию востребованного набора генов. Для этого бактериальные клетки используют разнообразные регуляторные системы, значительная часть которых функционирует во время транскрипции.
Эффективность транскрипции индивидуальных генов контролируется на всех стадиях транскрипционного цикла. В течение многих лет основное внимание исследователей было направлено на изучение механизмов регуляции транскрипции, действующих при взаимодействии РНК-полимеразы со специальными сигнальными участками ДНК: промоторами и терминаторами, расположенными, соответственно, в начале и в конце каждого гена или оперона. Эти участки ДНК имеют общие для разных генов особенности в их структурной организации и могут быть идентифицированы с помощью специальных алгоритмов. Копируемые во время транскрипции нуклеотидные последовательности генов строго индивидуальны. Тем не менее, они также содержат некоторые структурные особенности, которые прямо или опосредованно влияют на локальную скорость транскрипции и, проявляя зависимость от физико-химических факторов среды, могут приводить к существенному замедлению или даже остановке синтеза РНК. Классическим примером служит временная остановка РНК-полимеразы в лндерной области трнптофанового оперона E.coli, которая имеет важное физиологическое значение, поскольку является необходимым элементом регуляторного механизма (аттенюации), с помощью которого осуществляется контроль экспрессии соответствующей группы генов в зависимости от концентрации триптофана в клетке. Это и определяет актуальность детального изучения динамики процессивного движения РНК-полимеразы вдоль ДНК матрицы.
К настоящему времени наиболее признанной является модель «скользящего» движения РНК-полимеразы, в соответствии с которой монотонное движение фермента вдоль ДНК-матрицы может быть нарушено на участках, содержащих определенные регуляторные сигналы, закодированные в нуклеотидной последовательности транскрибируемой ДНК и (или) синтезируемого РНК-продукта. Считается, что решающую роль
играют такие сигналы, как наличие вторичной структуры на конце РНК-продукта и низкая стабильность РНК-ДНК гибрида, образующегося на расплетенной матричной нити ДНК, однако на локальную скорость синтеза РНК оказывают влияние и термодинамические свойства ~10-ти нуклеотидных пар нерасплетенной ДНК, также входящей в состав элонгирующего комплекса, и даже тип нуклеотида, расположенного на 3'-конце РНК-продукта. Вместе с тем, накопленные за последние несколько лет экспериментальные данные не всегда хорошо согласуются с предложенными моделями. Поэтому, существующие представления о механизмах регуляции транскрипции, действующих на стадии элонгации, требуют значительного уточнения. Прогресса в этой области можно достичь, используя комплексный подход, с привлечением современных генетических, биохимических, биофизических, а также статистических методов исследования.
Основные задачи работы. Данная работа является продолжением исследований, направленных на изучение молекулярного механизма продуктивного взаимодействия РНК-полимеразы E.coli с промоторами А1 и D бактериофага Т7, которые были начаты в лаборатории физико-химических механизмов функционирования генома, а затем продолжены в лаборатории молекулярных механизмов клеточного стресса ИБК РАН. Данные, полученные ранее, послужили отправной точкой для последующих исследований. Первоочередной задачей представленной работы было изучение функциональной значимости конформационного перехода, зарегистрированного ранее для комплекса РНК-полимеразы с промотором T7D при температуре ~30С, который не характерен для комплекса фермента с промотором Т7А1. При выполнении этой задачи было установлено, что повышение температуры приводит к снижению эффективности продуктивного синтеза РНК, инициированного с промотора T7D. Это послужило основанием для детального анализа динамики синтеза РНК с этого промотора, в процессе которого были решены следующие задачи:
- картированы места остановок синтеза РНК в транскрибируемой
области гена, прилегающей к промотору T7D;
- исследовано влияние первичной структуры прилегающей к промотору
транскрибируемой ДНК на свойства элонгирующего комплекса.
Заключительный этап работы состоял в поиске общих закономерностей в структуре прилегающих к промотору нуклеотидных последовательностей ДНК, потенциально значимых для динамики перехода транскрипционного комплекса к продуктивному синтезу РНК. Для решения этой задачи были использованы как статистические, так и экспериментальные методы исследования.
Научная новизна работы. В ходе работы установлено, что температурные условия являются фактором, определяющим соотношение двух типов инициирующих транскрипционных комплексов РНК-полимеразы E.coli с промотором T7D. Эти комплексы различаются между собой по
функциональным и структурным характеристикам. Один из них сохраняет способность в течение длительного времени осуществлять абортивный синтез коротких олигонуклеотидов, в то время как второй легко превращается в элонгирующий комплекс и переходит к продуктивному синтезу РНК. Таким образом, показана возможность регуляции процесса транскрипции в зависимости от температуры, заключающаяся в снижении выхода полноразмерного РНК-продукта в физиологическом диапазоне температур (30-37С).
В рамках данного исследования картировано положение остановок продуктивного синтеза РНК, осуществляемого с матрицы, контролируемой промотором T7D, и установлено, что их причиной являются особенности структурной организации транскрибируемой ДНК.
С помощью статистического анализа обнаружена неизвестная ранее общая особенность в первичной структуре транскрибируемой части генов, которая заключается в периодичном распределении А/Т-треков, и экспериментально показано возможное влияние этих элементов на динамику синтеза РНК.
Практическая ценность работы. Выявленное в данной работе новое свойство первичной структуры транскрибируемой ДНК, прилегающей к промотору, может быть использовано для построения усовершенствованных алгоритмов поиска промоторов и создания эффективных искусственных конструкций для генно-инженерных работ.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на 6-7-ой Европейских конференциях по спектроскопии биологических молекул (Франция, 1995; Испания, 1997); Конференциях по межмолекулярному взаимодействию и конформации макромолекул (Харьков, 1995; Тверь, 1997; Казань, 1999); И-ом Биохимическом съезде (Москва, 1997); П-ом Съезде биофизиков России (Москва, 1999).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на страницах