Введение к работе
~—--- -
,..;Актуальность проблемы. В настоящее время наблюдается суще-.. ственное усиление закислення окружающей среды, связанное с рос-'.' том-содержания в атмосфере окислов серы, азота и углерода, кото--рыё-'легко проникая через мембраны клеток и оболочки вирусов при "взаимодействии с внутренней средой этих объектов генерируют протоны соответствующих кислот. Поэтому исследование закономерностей влияния кислотности среды на жизнеспособность и изменчивость живых организмов связанных с повреждениями, возникающими в геноме при его протонировании становится актуальной задачей.
Будучи экзогенным фактором влияния на живые организмы, протоны среды в то же время, являются эффективным эндогенным факто-. ром регуляции внутриклеточных процессов, протекающих в том числе с участием нуклеиновых кислот.
В литературе имеется значительное число работ, посвященных исследованию влияния протонов среды на структурные превращения ДНК В растворе (Gushlbauer et al. , I968;2immer,Treibell , 1969;
Сухоруков и др., 1973; 1983; 1990). В результате этих исследований выявлены наиболее сильные протон-акцепторные центры и порядок протонирования их в ДНК. Обнаружено, что Н+- ионы при малых степенях протонирования {<*< 0,05) стабилизируют В-форму ДНК, при средних значениях (<* < 0,25) - осуществляют ее переход в новую конформацию ( S- состояние), а при больших степенях («;>
>0,25) - разрушают двойную спираль, образуя неупорядоченную конформацию (g- состояние). Предложен механизм стабилизации В--конформлции и модель а- состояния. Выявлены промежуточные состояния и механизмы В -»в и В -»g превращений. Исследованы кинетика и механизм разрывов гликозидных и фосфодиэфирных связей ДНК, а также дезаминирования азотистых оснований (Lindahl et al., 1972; 1974). В то же время при изучении протонирования ДНК in
aitu ни на один из этих вопросов ответ еще не получен. Вместе с тем, такие структурные особенности ДНК in situ как компактиза-ция и тесное взаимодействие с белками, могут определять особенности структурных превращений ДНК при ее протонировании. Для решения этих задач в работе были кспользоезны наиболее простые и удобные объекты - бактериофаги, широко используемые в качестве модели простейшего генома.
Цель и задачи исследования. Работа посвящена исследованию структурных изменений внутрифаговой ДНК, возникающих при ее протонировании и их связи с кислотной инактивацией фагов. Исходя
из этого были поставлены следующие задачи: I) получить кривые рН-зависимости выживаемости фагов, содержащих ДНК различного GC--состава, подвергнутых протонированию с последующей нейтрализацией и определить параметры их кислотной инактивации; 2) получить данные по экстрагируемости ДНК из фагов, подвергнутых действию Н+- ионов различной концентрации с последующей нейтрализацией и для этих препаратов исследовать трансфецирующую активность количество остаточного белка и содержание в нем кислых и основных аминокислот; 3) изучить роль ДНК-белковых взаимодействий как фактора способного определять особенности повреждений генома, возникающих при его протонировании; 4) исследовать УФ- и КД-спе-ктры при различных кислых значениях рН, а также кривые потенцио-метрического титрования интактных и разрушенных фагов в связи с изучением особенностей протонирования ДНК in situ по сравнению с ДНК в растворе и кислотной инактивации вирионов; 5) изучить взаимосвязь особенностей изменений физико-химических свойств ДНК при ее протонировании in situ с пространственной организацией внутрифаговой ДНК.
Научная новизна. Получены кривые выживаемости фагов Т4, ТЗ, Сд,Я и определены параметры их кислотной инактивации. Показано, что фаги по кислотной стабильности распологаются в ряд: Т4>Сд> Л> ТЗ, из которого .следует, что рН-чувствительность вирионов возрастает с ростом QC-содержания их ДНК. Установлено, что кислотная инактивация фага при небольшом смещении рН от нейтрального значения к кислым обусловлена повреждениями внутрифаговой ДНК, при значительном же подкислении среды - о нарушениями структуры белков капсиды вириона, возникающих в результате агрегации фаговых частиц.
Проведен анализ экстрагируемости ДНК из фагов подвергнутых действию Н+- ионов различной концентрации с последующей нейтрализацией среды , из которого следует, что ухудшение экстрагируемости с ростом GC-содержания фаговой ДНК и понижением рН среды связано с возникновением нековалентных и ковалентних сшивок ДНК--белок. Показано, что нековалентные сшивки возникают при небольшом смещении рН от нейтрального значения к кислым ив их образовании участвуют GC-пары ДНК и остатки глутаминовых ( Glu) и ас-парагиновых ( Asp) кислот белков нуклеокапсиды. Ковалентные -сшивки образуются лишь при значительном подкислении среды и представляют собой шиффово основание, возникающее между -аминогруппой лизиновых остатков белков и альдегидной группой открытой формы пентозы при апуриновых сайтах ДНК. Образование сшивок ДНК-
- белок является основной отличительной особенностью необратимых структурных изменений ДНК, возникающих при ее протонировании in situ по сравнению с ДНК in vitro. Помимо ее выявлены также особенности механизма непосредственно самого процесса протонирова-ния ДНК in situno сравнению с ДНК в растворе. Установлен порядок протонирования различных фрагментов нуклеокапсиды фага.
Исходя из особенностей изменения свойств ДНК при ее протонировании in situ по сравнению с ДНК invUi-'o, предложена модель пространственной структуры ДНК внутри вириона.
Практическая значимость. Из полученных нами данных следует, что наряду с влиянием Н+-ионов на ферментативную активность возможен еще один путь регуляции протонами среды внутриклеточных процессов происходящих с участием нуклеиновых кислот, который связан с их действием непосредственно на структуру ДНК.
Обнаруженные в работе нековалентные сшивки в местах контакта GC-nap ДНК с Glu или Asp белков и предложенный механизм их образования важны для понимания молекулярных принципов нуклеино-во-белкового узнавания, механизма действия кислых белков на структуру и функции ДНК, а также позволяет понять причину возникновения изломов двойной спирали в области GC-nap, которые наряду с изгибами в области АТ-пар могут способствовать эффективной упаковке ДНК в составе хроматина и вирусных нуклеокапсид. Существование таких нековалентных сшивок ДНК-белок может объяснить феномен резкого возрастания частоты спонтанных и индуцированных мутаций типа транзиций QC * AT.
Возникновение при подкислении среды и последующей ее нейтрализации сшивок ДНК-белок как нековалентной, так и ковалентной природы могут представлять интерес для радиобиологии, поскольку в треках ионизации, в водной среде, происходит и значительное повышение кислотности среды.
Полученные нами результаты исследования агрегационных эффектов, наблюдающихся при протонировании ДНП-комплексов могут объяснить причину нерасхождения хромосом при делении клеток и возникновения аномалий, лежащих в основе широкого круга наследственных болезней. Представленные в работе данные важны также для понимания причин и факторов отбора в процессе эволюционного развития живых систем.
Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на УІ симпозиуме СЭВ по биофизике белков и нуклеиновых кислот (Сегед, Венгрия, 1983), на международной конференции
"Взаимодействие ДНК с белками и лигандами" (Тбилиси, 1990) и на УІІ конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991). Структура и объем диссертации. Диссертационная работа содержит: введение, главу - обзор литературы (3 раздела), главу-- материалы и методы, 3 главы, в которых представлены результаты эксперимента и их обсуждение, заключение, выводы и описок цитируемой литературы, насчитывающей 196 наименований, из них 58 отечественных и 138 зарубежных публикаций. Работа изложена на 164 стр. машинописного текста, включая 35 рис. и 7 таблиц.