Введение к работе
Цель и задач» исследования Основной целью данной работы является
изучение принципов организации нативной структуры сложных мультидоменных белков. Разработка подходов и методов анализа калориметрических данных, позволяющих получать структурно-термодинамическую информацию об организации их нативной структуры и переходном (активированном) состоянии.
Актуальность проблемы. Подавляющее большинство белков представляют собой крупные мультидоменные образования. О структурных и термодинамических принципах образования и поддержания таких сложных систем известно не так уж много. Структура многих белков метастабильна и поддерживается отнюдь не из-за ее термодинамической выгодности. Что удерживает такие белки от денатурации? Какова природа энергетического барьера, отделяющего нативное состояние от денатурированого? Что представляет собой переходное (активированное) состояние? Какими факторами определяется разбиение структуры белка на отдельные термодинамические домены? Ответить на все эти фундаментальные вопросы невозможно без обширного экспериментального материала. С другой стороны, экспериментальные возможности в этом плане крайне Офаничены. По сути, кроме сканирующей микрокалориметрии не существует надежных методов определения доменной организации макромолекул.
Еще хуже обстоит дело с изучением переходного состояния. Это состояние виртуально. Нет никаких шансов зафиксировать его при каких-либо условиях и попытаться изучить его равновесными методами. Единственный путь получить хоть какую-нибудь структурную информацию об этом состоянии - это проследить за изменением его энергетических параметров при изменении внешних условий. Известные корреляции между структурными и термодинамическими параметрами могут позволить что-либо сказать о переходном состоянии в структурном плане.
Решение вышеуказанных проблем предоставляет сканирующая микрокалориметрия. Наличие доменов в структуре молекулы приводит к появлению промежуточных состояний при повышении температуры, что не может не отразиться на кривых плавления. Кинетические параметры денатурации также могут быть получены в определенных случаях из кривых плавления. Однако, извлечение вышеуказанной информации из калориметрических данных требует разработки соответствующих подходов и методов анализа, что и сделано в данной работе.
2 Научная новизна. В работе впервые была использована сканирующая
микрокалориметрня для получения структурно-термодинамической информации о
переходном состоянии белков в ходе тепловой денатурации. Проанализированы
соответствующие кинетические модели. Одним из важнейших результатов использования
такого подхода стал важный вывод о том, что переходное состояние является компактным
слабогидратированым состоянием, а изменение структуры белка при активации охватывает
далеко не всю молекулу.
Для анализа термодинамических моделей использовался специально разработанный нами аппарат обобщенных переходов между двумя состояниями. Этот аппарат устанавливает взаимно однозначное соответствие между любым комплексным числом и определенным пиком теплопоглощения. Как показано в данной работе, обобщенная модель переходов между двумя состояниями порождает вырожденный базис по отношению к любой термодинамической системе и существенно упрощает анализ поведения сложньк термодинамических моделей, в том числе и при наличии междоменных взаимодействий.
В диссертации рассматриваются методы анализа равновесных калориметрических кривых на основании статистической суммы системы. Изучены вопросы устойчивости алгоритмов и допустимая область их применения. Разработанные методы анализа позволяют во многих случаях рассчитать число и термодинамические параметры стабилизации структуры промежуточных состояний белка, реализующихся во всем рабочем температурном интервале. Наиболее впечатляющим результатом этого направления является построение карт доменной организации для ряда фибриллярных белков. Полученные карты доменной организации подтверждаются результатами ограниченного протеолиза молекул. Показано, что существует определенная корреляция между границами устойчивых протеолитических фрагментов и границами кооперативных термодинамических доменов.
Практическая ценность работы. Полученные результаты значительно расширяют наши знания о природе переходного состояния и принципах поддержания нативной структуры сложных мультидоменных белков. В ходе выполнения поставленных задач разработаны подходы и методы анализа равновесных и неравновесных микрокалориметрических кривых. В частности, значение разработанной теории обобщенных переходов между двумя состояниями не ограничивается продемонстрированными примерами. Теория может быть использована и в дальнейшем как для анализа поведения сложных термодинамических систем, так и для описания реальных калориметрических данных. Компьютерные программы анализа
з калориметрических данных, созданные на основе разработанных алгоритмов,
используются в нескольких лабораториях мира.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из семи частей,