Введение к работе
Актуальность темы. Наилучшей проверкой нашего понимания принципов структурной организации белков является конструирование такой аминокислотной последовательности искусственного белка, которая сформирует заранее заданую пространственную структуру. Основная часть работ в этом направлении делается на основании повторения структурных мотивов природных белков, при этом часто используются фрагменты натуральных аминокислотных последовательностей. С нашей точки зрения, более интересная задача - синтез искусственного белка с последовательностью, не гомологичной последовательностям природных белков, и с типом пространственной укладки, который не противоречит известным принципам структурной организации белков, но в природных белках не обнаружен.
Модель такого белка (с таким типом укладки) была предложена в 1988 г. в лаборатории физики белка на основании молекулярной теории вторичной структуры и укладки белковых цепей. Это небольшой полипептид с последовательностью из 73 аминокислотных остатков. Его молекулярный вес 7.6В2кЯа. Это белок со структурой типа "бутерброд", включающий (3-лист из четырех антипараллельных нитей, одна сторона которого прикрыта парой а-спиралей. Такая укладка состоит из дважды повторяющегося а(3/3 фрагмента, поэтому белок был назван "альбебетин". Предложенная структура отвечает всем известным принципам формирования структуры глобулярных белков. Похожий тип укладки позднее был обнаружен в доменах некоторых природных белков. Это говорит о том, что выбранный тип укладки не только не противоречит известным принципам структурной организации белков, но и используется в природе.
В настоящее время конструирование и исследование искусственных белков (белков сГе novo) находятся в центре внимания большого количества исследовательских коллективов, а конструирование жесткой третичной структуры или расшифровка реальной пространственной структуры этих белков являются лишь перспективной задачей. Поэтому, данная работа, безусловно, является актуальной.
Цель работы. Основной целью настоящей работы являлось получение и исследование альбебетина - искусственного белка с заданной пространственной структурой. В процессе работы было принято решение получить две модификации альбебетина и провести сравнительное изучение их структурных свойств.
Научная новизна.
В настоящей работе разработан новый подход к исследованию
искусственных белков, позволяющий обойти трудности, возникающие при экспрессии чужеродных и мутантных белков в клетках Е. coli. Этот подход состоит из синтеза в бесклеточной системе трансляции радиоактивномеченного белка с последующим исследованием, без предварительной очистки, методами, чувствительными к радиоактивной метке, такими как гельфильтрация, электрофорез в горизонтальном градиенте мочевины, ограниченный протеолиз. Эти методы дают информацию о компактности и стабильности белка. В результате удается довольно быстро ответить на вопрос, является ли данный искусственный белок компактным и стоит ли пытаться получить его в препаративных количествах для стуктурных исследований. В противном случае надо улучшать первоначальный дизайн и повторить процесс тестирования
Этот подход был применен к белку de novo, названному <альбебетин». Было показано, что он почти столь же компактен, как и природные белки, что он кооперативно разворачивается в больших концентрациях мочевины и имеет, по крайней мере, некоторые черты пространственной структуры, согласующейся с теоретически сконструированной.
В дальнейшем по этой методике были исследованы еще два белка de novo, модификации альбебетина, - альбебетин с фрагментом интерферона и половинка альбебетина. Было показано, что оба полипептида компактны и их размеры соответствуют размерам природных белков аналогичного молекулярного веса, и что альбебетин с фрагментом интерферона биологически активен.
Практическая ценность.
Разработанный в данной работе подход представляет очень эффективный метод предварительного исследования как искусственных, так и мутантных белков, поскольку он позволяет достаточно быстрс получить ответ на вопросы, имеют ли эти белки компактную структуру, насколько они стабильны к действию протеаз и денатурантов и нужно ли пытаться синтезировать их в препаративных количествах или же надо улучшать первоначальный дизайн. Этот подход применим при создании искусственных и мутантных белков для выбора лучшегс варианта последовательности, дающей компактный стабильный белок.
Эта работа дала толчек к продолжению исследования альбебетина. После долгих попыток была найдена система для экспрессии ь клетках Е. coli и в настоящий момент ведется исследование третичной структуры альбебетина методом двумерного ЯМР.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались ил>
были представлены на:
международной школе-семинаре "Modern Problems of Physical Chemistry of Hacromolecules" в г. Пущино (1991 г.),
симпозиуме серии "keystone" по молекулярной и клеточной биологии "Protein Folding, Structure and Funktion" (Jorn. Cell. Biochem. 1991, 15G, Suppl., 207),
международной конференции "Protein Biosynthesis", в г. Пушино (1991 г. ),
первом международном симпозиуме CAPE "Prediction and Experiment. Three-Dimensional Structures of Homologous Proteins", в Германии, (Брауншвейг 1991 г. ),
5-й конференции Российской федерации "Новые направления биотехнологии", в г. Пущино (1992 г.),
зимнем симпозиуме "Advances in Gene Technology: Molecular Biology and Human Disease" в Майами (Protein Engin., 1993, 6, Suppl, 122)
пятой международной летней школе по биофизике в Хорватии (Ровинь, 1994 г. ).