Введение к работе
Актуальность проблемы. Вся биосфера земли своим существованием прямо или косвенно обязана процессу фотосинтеза, в результате которого электромагнитная энергия света, поглощенного фотосинтези-рувдими организмами, запасается в виде энергии химических связей. Актуальность задачи выяснения механизмов этого физико-химического процесса, в частности, его первичных физических стадий, и принципов структурно-функциональной Организации фотосинтезирувдего аппарата, определивших високую эффективность первичных стадий конверсии энергии света в природном фотосинтезе, - очевидна, ибо чоловечество силой своего исторического развития подводится к мо-манту. когда проблема искусственного фотосинтеза станет перед ним как важнейшая н определяющая его судьбу на.нашей планете.
Цель и задачи исследования. В соответствии с выдвинутой концепцией жесткой 0ПТИШ38ЦИИ структуры фотосинтезирувдего аппарата по функциональному критерию, целью настоящего исследования являлся поиск принципов структурно-функциональной организации природных антенн, оптимизирующих их функцию. Решались следующие задачи:
-
В цикле теоретических исследований, используициі.в частности, математическое моделирование функционирования антенн природных фотосивтетических единиц (ФСБ), осуществлялся поиск принципов организации оптимальных светособиращих систем.
-
В цикле экспериментальных исследований осуществлялся целенаправленный поиск в природных антеннах тех ее структурных свойств, которые были предсказаны теоретически для оптимальных модельных сзвтосоОиравдих систем.
Научная новизна а практическая ценность работа. Выдвинута концепция, согласно которой структура фотосинтезируицего аппарата должна быть жестко оптимизирована для достижения экспериментально измеряемой величины квантового выхода первичного разделения зарядов в реакционном центре (РЦ). В процессе разработки этой концепции было предсказвно теоретически, а затем подтверждено экспериментально существование в природных антеннах ряда структурных фэкторов, оптимизирующих функцию антенны.
В частности:
(і) Математическое моделирование гетерогенного переноса анер гии электронного возбуждения от антенны к РЦ в зеленых серных бая териях c.iimicoia позволил предсказать существование не известной в то время субантенны для оптимального сопряжения переноса энергии от хлоросомальной БХл с-антенны к мембранной БХл а-антенне. Это предсказание вскоре было подтверждено западными учеными, которые открыли промежуточную хлоросомальную БХл а-антенну.
(2) Проведенные модельные расчеты показали,что в оптимальных
светособиравдих антеннах векторы дипольних моментов о -переходов
антенных молекул должны быть взаимно параллельны и направлены
вдоль длинной оси элементарной ФСБ. Поиск реализации этого прин
ципа структурной организации в хлоросомальной антенне зеленых ба
ктерий привел к открытию предсказанной строгой оривнтационноЕ
упорядоченности векторов дипольних моментов Q -переходов БХл С.
Методом поляризационно-флу.оресцентной спектроскопии высокого временного разрешения было показано in situ, что перенос энергии по хлоросомальной антенне происходит по хромофорам БХл с (или пх сильно связанным ассоциатем) с параллельными дипольними моментами длинноволновых q -переходов.
Методом линейного дихроизма было показано, что векторы дипольних моментов о -переходов БХл с (і) взаимно параллельны я (2) направлены вдоль длинной оси хлоросомы.
(3) Проведенные модельные расчеты показали, что олигомериэа-
ция антенных пигментов - как эффективный оптимизирующий структуру
фактор - биологически целесообразна.
Методом выжигания спектральных провалов при температура вадкого гелия (l.e к) было получено прямое экспериментальное доказательство олигомерной организации хлоросомального БХл с в интакт-
ННХ Клетках ЗелеНЫХ бактерий C.Uraicola И C.aurantiacus. ВПврШв
был прямо измерен спектр полосы о-о перехода энергетически низшего акситонного уровня олигомера БХл с.
Исследования структурно-функциональной организации хлоросома (самой большой природной антенны) показали, что ее структура действительно оптимизирована по Функциональному критерию,обеспечивая требование направленности переноса энергии к РЦ с эффективность! этого процесса, близкой к юо%.
Проведенный цикл теоретических и экспериментальных исследований важен как с точки зрения фундаментального знания, так и с точки зрения проблемы создания оптимальных технологически простых искусственных светопреобразующих систем.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлв ны на vi-n Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений (Львов, 1980); v-ом, vi-ом, vii-om, viii-ш и IX-OM Международных конгрессах по фотосинтезу (Халкидики, 1980; Брюссель, 1983; Провиденс, 1986; Стокгольм, 1989,- Нагойя, 1992); iv-ом Международном Семинаре по переносу энергии в конденсированных средах (Прага, 1981); 1-ом Всесоюзном биофизическом сезде (Москва, 1982); IV-ОМ, V-OM, VI-OM и vii-om Международных симпозиумах по фотосинтетичоским прокариотам (Бомбанне-Бордо,1982; Гриндельвальд, 1985,- Нордвийкерхоут, 1988,-Амхерст. 1991); vii1-ом Международном биофизическом конгрессе (Бристоль, 1984); v-ой и viii-ой Международных конференциях по фотохимической конверсии и запасании солнечной энергии (Осака, 1984,- Палермо, 1990); Иевдународном симпозиуме по биоконверсии солнечной энергии (Пущино, 1984); и-ой Всесоюзной конференции
"ВОЗОбНОВЛЯвМЫе ИСТОЧНИКИ ЭНерГИИ" (Ереван, 1985); ХІ-ОМ И ХІІ-ОМ іиРАС-симпозиуме по фотохимии (Лиссабон, І98В; БОЛОНЬЯ, 1988); Международном конгрессе по возобновляемым источникам энерпш (Мадрид, 1986); Рабочем совещании еиво по зеленым фотосиптезирущим бактериям (Найборг, 1907); п-ой Всесоюзной конференции "Фотокаталитическое преобразование солнечной энергии'" (Ленинград, 1987); .Семинаре "Лазерная спектроскопия слокных молекул" (Лохусалу,1933); Ыепдународном симпозиуме fems "Молекулярная биология мембран-связанных комплексов в фототрофных бактериях" (Фрайбург, 1989); xv-ой Международной конференции по фотохимии (Пария, 1991); Всесоюзной конференции по люминесценции (Москва, 1991); Гордоновской конференции по фотосинтезу (Андовер, 1991), Рабочем совещании емво по зеленым и гелиобакгариям (Найборг, 1993), а также на семинарах ШЭД Физико-химической биологии им. А.К.Белозерского МГУ, лаборатории люминесценции Физического института гол. П.И. Лебедева Российской Академии Наук и лабораторій лазерной спектроскопии Института физики Эстонской Академии наук.
I. Метод расчета кинетики миграции энергии в ФСБ
Теоретический поиск принципов организации оптимальных ФСБ осуществлялся моделированием миграции энергии электронного возбуждения в модельных ФСБ с регулярной решеткой. В основу расчета индивидуального влияния различных структурных факторов на эффективность функционирования ФСБ положена модель, для которой безразлично, находится ли в каждом узле решетки одна молекула пигмента, димер или более крупный кластер молекул, связанных сильным экси-тошшм взаимодействием. Влияние кластеризации при этом было рассмотрено отдельно. Движение экситона между узлагли решетки считвли некогерентннм и осуществляющимся по индуктивно-резонансному механизму. Будем считать, что в каждый момент времени возбуждение сосредоточено в одном узле решетки и через время At может с определенной вероятностью оказаться в некотором другом узле решетки. Согласно теории ферстера, вероятность передачи энергии электронного возбуждения от го-го узла решетки (донора) к n-му (акцептору), Pmn, за время At зависит от расстояния между ними, взаимной ориентации передающего и принимающего диполей и Олизости их энергетических Уровней [Forster, 1948; 1965):
га 6 *ron L xo Rmn J
At , (I)
To Kmn J v
где С = const, a Rran есть расстояние между передающим (m) и принимающим (п) диполями. Ориентационный фактор kmn равен:
)cmn.'» cosot - 3cosfim cos(3n, (2)
где a - угол между направлениями этих диполей, а Рп и рп - углы между каждым из них и радиус-вектором, соединяющим их центры. Интеграл в уравнении (I) определяется произведением спектра люминесценции (в числе квантов на интервал частот) ьт(")' донора, нормированного К ЄДИНИЦЄ:
Г L {v[uv - 1 , . (3)
і т ' _ го
и спектра поглощения Ап(и> акцептора. Естественное время жизни т0 в уравнении (I) может быть вычислено из уравнения Ферстера:
-і-с* f
ЛЯ*»- v)3
где c*= const, v - волновое число точки . "зеркальной симметрии"
- . kn(v)&v . (4)
между полосами поглощения и люминесценции донора га, а интегрирование ведется по 0—>i голосе поглощения донора. Вероятность того, что за малое время at возбуждение останется в том же узле
РЗШ8ТКИ, Р^, ОПРОЛЗЛЯвТСЯ СУММОЙ Рпп ГО ВСЄМ п га:
Р„.т - 1 - 7 Pmn At (5)
Для моделирования шграции энергии по ФСЕ Оыл использован метод матриц вероятностей. Величины рип образуют квадратную матрицу порядка n, где n - число молекул в элементарной ФСЕ. К8вдый элемент 8ТОЙ матрицы дает вероятность того, что возбуждение, находящееся узле решетки в в момент времени t, Судет находиться в узле решетка п в момент времени t+ut. РЦ рассматривается как одна из молоку л той жа ФСЕ (с номером г), но вероятность передачи энергии вычислялась по формуле (I) только для передачи от антенны к РЦ. Вероятность ее обратной передачи задавалась отдельно. При эффек-тившсти захвата возбуждения реакционным центром, Ф,.,равной 100%
ргп prr - 1 <6>
Чтобы найти распределение вероятности нахождения возбуждения шп)
в молекулах ФСЕ в момент времени At, надо умножить матрицу {Pmnj
на линейную матрицу порядка и, задающую начальное распределение
ЕвроЯТНОСТИ (Qn(0)f:
{Qn(At,}-{pmn}{on(0)} (7)
Считали, что Qn(0) = i/n независимо от п. Для нахождения {Qn(2At)} надо повторить эту операцию:
{ Qn<2At>} " { Pnm} { 0П<4*)} (8)
и т.д. Каждый раз величина
Ог - 1 -^ Qn (9)
n»r дает вероятность того, что возбуждение попало в РЦ, а число циклов умножения характеризует в некотором условном масштабе время, прошедшее с момента возбуждения антенны. Число циклов, необходимое для того, чтобы qe достигло определенной величины, характеризует эффективность миграции энергии к РЦ (время захвата энергии возбуждения РЦ), ибо в течение всего времени миграции возбуждения го антенне возможна его дезактивация по тривиальным механизмам. Вычислялось количество этих циклов, необходимое для того, чтобы сумма в уравнении (9) уменьшилась до величины е-1, е~2 и 0.1,
т.е., чтобы Qr достигло величины 1-е-1 , 1-е"2 и 0.9. Времена, соответствующие этим величинам, обозначим через t1( t,, t,. Вычисленные значения t были нормированы таким образом, что масштаб времени - одинаков для всех сравниваемых случаев. Полагали, что в первом приближении можно считать ршп* о только для передачи мевду ближайшими соседями, что не всегда справедливо для упорядоченных систем. Границы элементарных ФСЕ (т.е. имеющих один РЦ) считались полностью отражающими, что равнозначно предположению о трансляционной симметрии ФСБ. Этим учитывался мультицентральный характер ФСЕ. При моделировании миграции энергии для определенности были выбраны спектры поглощения, близкие к спектрам ряда пурпурных бактерий. При моделировании миграции энергии в ФСЕ, решетки которых имеют кластерное строение, были использованы спектральные характеристики мономеров и димеров ЕХл а и ЕХл с для ряда конкретных систем как in vitro, так и in vivo.
Из-за малой скорости счета при больших n мы ограничились моделями ФСЕ малых размеров. Заметим, что конкретизация структурных параметров модельных ФСЕ не ограничивает общности рассмотрения взаимосвязи структуры и функции ФСЕ. Поэтому принципиальные выводы, полученные в настоящем цикле работ, останутся в силе и для больших ФСЕ, а также для ФСЕ с другими структурными параметрами.
2. Оптическая спектроскопия фотовыжигания провала
Успех оптической спектроскопии фотосинтетических пигментов in vivo в последнее десятилетие в большой степени связан с применением лазеров и низких температур. Широкие возможности для тонких спектроскопических исследований сложных молекул в самых различных средах открылись после выяснения роли неоднородного упшре-ния в их спектрах. Последнее явление свойственно ансамблю примесей и обусловлено многообразием локальных окружений примесей в реальной среде. Эффективным методом устранения неоднородного уши-рения является фотовыжигание спектральных провалов, позволяющее измерять однородный спектр индивидуальной примеси. Для исследования взаимодействия примеси с окружающей матрицей очень важным является вопрос об измерении статистического распределения однородных спектров всего ансамбля примесей, в частности, измерение так
.6 -
зазываемой функции неоднородного распределения (ФНР) частот электронного перехода. Выделение однородных спектров и ФНР является важной предпосылкой при исследования различных физических явлений с участием электронно-колебательных возбувдекий в неоднородных системах (перенос энергии и др.).
Для решения ряда задач, связанных с анализом спектров природных энтенных структур, мы использовали метод фотовыжигания провала в спектрах флуоресценции интактных клеток фотосинтезирувдих бактерий и спектрах ее возбувдешя при температуре 1.6 - 5 к. В использованной спектроскопической установке в качестве источника возбувдения применялся непрерывный лазер на красителе Оксазин-1 (ширина линии 0,5 см"1), накачиваемый криптоновым ионным лазером (Coherent CR-2000S). Часть интенсивности лазерного луча (-8) отражалась стеклянной пластинкой и регистрировалась как сигнал сравнения силиконовым фотодиодом измерителя мощности (модель
460-lA, EG&G BloctroOptics). СпеКТРЫ ВОЗбуЭДОНИЯ <&ПУОрЄСЦ8НЦИЙ
взгэрены без коррзкции на спектральную чувствительность фотодиода. Олуоресценция регистрировалась фотоумножителем исл сзюэа а-02 в рзшлз счетчика фотонов через двойной спектрометр ДФС-24 (дисперсия 0.45 нм/мм; ширина щелей 0.1-0.2 км). Оба сигнала регистрировались многоканальным анализатором lp 4900 в (Nokia), сопряженным с персональным кошьвтером 3273 (NCR). Флуоресценции регистрировали в ракше отражения. Спектральная область возоуадения - от Є80 до 790 ем; область- регистрации - до 1000 им. Мощность выжигания варьировали от 0,5 мв/см2 до 5 В/см2, а длительность - от 250 сек до 65 мин. Облучаемая шэдадь образца составляла несколько квадратных миллиметров. Все измерения как правило проводили при температуре сверхтекучего галия.
3. Оптическая абсорбционная спектроскопия з линейно поляризованном свете
Для исследования взаимной ориентации векторов диполышх моментов переходов свэтособпра&аих ппгглзптов использовали метод ли-' нейного дихроизма, предполагающий измерения спектров поглощения ориентированных образцов в линейно поляризованном свете.
Оряептироввняе объектов (сгеряиообрязпой фортлы) достигалось ссссимметричЕой механической деформацией полимэра,' в который они
были встроены по методу Абдурахманова (1978), Параметр осесиммет-ричной деформации, н, определяли отношением конечной к исходной длине полимера. Для образцов с разным параметром деформации измеряли спектры поглощения в линейно поляризованном свете. Измерения
ПРОВОДИЛИ С Использованием спектрофотометра Specord М-40 (K.Zeiee)
с помощью двух инфракрасных поляроидов (к.Zeiss). Измерялись спектры А, и Ак, соответствующие поглощению света, поляризованного соответственно параллельно и перпендикулярно оси ориентации образца. Мерой линейного дихроизма служила величина степени дихроизма Р «= (А„ - АХ)/(А, + АХ). Анализ спектров линейного дихроизма проводили, используя теоретическую модель ориентирования в трехмерной сетке аморфного полимера жестких осесимметричшх частиц, имеющих
форму СТерЖНЯ (Kuhn, Grun, 1942; TanizaJci, 1965J. ЭТЭ ЮДОЛЬ ГО-
зволяет связать аналитически две измеряемые величины, р и ы, с третьей, искомой, т.е. углом а между направлением вектора дипольного момента перехода, соответствующего измеряемой полосе поглощения, и осью симметрии частицы.
4. Кинетическая поляризационно-флуоресцентная спектроскопия пикосекундного временного разрешения
Для изучения некоторых структурных аспектов миграции энергии по светособиращей антенне в пикосекундном диапазоне, был использован спектрохронограф, построенный в Институте физики АН Эстонии. Установка использует импульсное (квазинепрерываое) возбуждение от синхронно накачиваемых лазеров на красителях и систему регистрации флуоресценции на основе электрошю-оптической камеры,: работающей в режиме непрерывной гармонической развертка, синхронизованной с импульсами лазера. Источником пикосекуидных импульсов возбуадаю-щего света в диапазоне 680-800 нм служил лазер на красителе Окса-зин-1 (spectra-Physics), с длительностью импульсов 3 пс, синхронно накачиваемый с частотой 82 МГц. криптоновым ионным лазером с активной синхронизацией мод оптико-акустическим модулятором. Возбуждающий свет был вертикально поляризован. Использованная интенсивность возбуждения (0,2 В/см2) исключала процессы аннигиляции ак-ситонов. Флуоресценция объектов регистрировалась под ?трямым углом к направлению возбуждающего луча (в режиме отражения) через монохроматор С ПОМОЩЬЮ СТрИК-КВМерЫ (Hamaraatsu), работающей В рвНИМв
накопления сигналов флуоресценции, возбуэдаемой каждым лазерным импульсом. Стрик-каыера сопряжена с оптическим многоканальным анализатором (osa 500) и ЭВМ EC-IOIO. Спектральная область регистра-рации прибора - 350 1100 ем; спектральное разрешение - 7 см-1; Браненное разрешение - 3-5 пс; ширина аппаратной функции регистрирующей системы на полувысоте - 10-15 пс (в приводимых экспериментах pwhm - їв пс). Поляризационные измерения проводили с использованием двух инфракрасных поляроидов (к.Zeiss),положение которых оптимизировали по релеевскому рассеянии света раствором гликогена. Поляризвция флуоресцэнция p(t) определялась соотношением p(t) - [iB(tj - rx
5. Объекты исследований
Экспериментальный поиск в природных ФСБ структурных оптимизирующих фзкторов, найденных теоретически, логично было проводить среди СЕотосинтезирущих организюв с большими ФСБ, т.к.требования к оптимизации их структуры более жесткие, чем для малых ФСБ. Поэтому в качестве объекта исследований были выбраны зеленые бактерии семейства chiorobiaceae,. антенна ФСЕ которых на порядок больна (до 4000 шлекул на один реакционный центр), чем в других фо-тосштезирушщ организмах. Своим размером ФСЕ этих бактерий обязана хлоросомз, самой большой (среда всех известных) природной субантенна.. Именно в этой субантеннз мошэ было надеяться на реализацию, нескольких структурных оптнмлзцрувдих факторов одповрз-мвино. Для оСобщэния притптивльных результатов, полученных при изучения хлоросомальной антеинн chiorobiaceae, ш исследовали зз-
ЛЭНЫЗ баКТерШ И ВТОРОГО СОМЭЙСТВЗ,. Chlorofloxaceae, зволюционио
далекого от первого, хлоросомальнэя антенна которых, однако, не' превышает 300 молекул на один РЦ. Ш исследовали по одному виду аз каадого семейства, а именно, зеленые серше бактерии сыогом-un limicoia, штамм С, п золаше термофильные несернне бактерии
Chloroflexu3 aurantlacus, ПТШШ ВШ (ИЗ ІЮЛЛЄКЦШІ КУЛЬТУР К8фЭД-
ры микробиологии биологического факультета МГУ).
Препараты хромзтофоров (хлоросомо-мембранные комплексы) получали из клеток с.limicoia, используя ультразвуковую обработку клеток, дифференциальное центрифугирование с последущей очисткой в сахарозном градиенте. Однородность препарата анализировали с помощью электронного микроскопа H-I2 (Hitachi). Спектрофотометри-ческий контроль объектов осуществляли с помощью спектрофотометра
Hitachi 557 И СПбКТРОфЛУОриметров Amlnco-Bowman И MPF-4 (Hitachi).