Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках Кротова Карина Евгеньевна

Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках
<
Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках
>

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Кротова Карина Евгеньевна. Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.02 : Пущино, 2003 107 c. РГБ ОД, 61:04-3/239-9

Содержание к диссертации

Введение

1 . Окись азота как биомедиатор 6

1.1 Открытие N0 как биомедиатора и ферментов, участвующих в его синтезе 6

1.2 Роль и механизм действия N0. 10

2. CAT - семейство переносчиков L-аргинина у млекопитающих 15

2.1 Мембранный транспорт L-аргинина 15

2.2 Структура и тканевое распространение переносчиков CAT семейства 17

2.3 Локализация САТ-1 внутри клеток 20

2.4 Транспортные свойства семейства CAT 22

2.5 Характеристика аргининового транспорта в эндотелиальных клетках легочной артерии свиньи 24

2.6 Регуляция активности CAT переносчиков 25

3. Обеспечение NO-синтазы субстратом как фактор регуляции продукции N0 28

3.1 Роль переносчиков семейства CAT в обеспечении субстратом NO-синтазы и "аргининовый парадокс" 28

3.2 Кавелии - компартменты плазматических мембран, насыщенные 33

молекулами сигнальных каскадов.

2 Результаты 47

1. Эффекты КТ на транспорт L-аргинина в ЭК 47

1.1 Коклюшный токсин (КТ) активирует захват аргинина ЭК. 47

1.2 Gcij АДФ-рибозилирование участвует в КТ-вызванной активации транспорта L-аргинина. 51

1.3 Эффекты КТ на транспорт аргинина опосредованы через снижение в активности классических изоформ ПКС. 57

2. Повышение продукции N0 в КТ-обработанных клетках 60

3. РМА восстанавливает транспорт аргинина, измененный после обработки ЭК экстрактом сигаретного дыма или липополисахаридами 67

4. Идентификация ПКС изоформ, участвующих в регуляции транспорта аргинина в ЭК. 69

4.1 Эффекты РМА на транспорт аргинина 69

4.2 Эффекты THY и PIP на транспорт аргинина. 73

4.3 Роль кавелий в эффектах РМА на транспорт аргинина 78

Введение к работе

Эндотелиальные клетки (ЭК) являются богатым источником окиси азота (N0), свободного радикала с уникальной физиологической биорегуляторной активностью, с помощью которого ЭК регулируют тонус гладкой мускулатуры сосудов при нормальном состоянии и при различных воздействиях. Некоторые болезни, такие как атеросклероз, гиперхолестеремия, гипертензия, диабеты и сердечная недостаточность сопровождаются изменением в продукции N0 эндотелиальными клетками, что приводит к нарушениям в регуляции тонуса сосудов. Поэтому, понимание механизмов регуляции продукции N0 представляет собой важную практическую задачу. ЭК образуют окись азота из L-аргинина через каталитическое действие эндотелиальной NO-синтазы. Поставка аргинина из экстраклеточной среды внутрь клеток может служить регуляторным фактором в продукции N0. Целью работы является изучение сигнальных путей регуляции доставки аргинина в ЭК. Экспериментальной моделью для этой работы являлась первичная культура ЭК артерии легкого свиньи. Эти клетки содержат специализированный переносчик для катионных аминокислот (САТ-1), обеспечивающий доставку аргинина внутрь клеток. Недавно было показано, что в ЭК переносчик САТ-1 может формировать NO-продуцирующую функциональную единицу с эндотелиальной NO-синтазой (eNOS), где субстрат (аргинин) может непосредственно доставляться к ферменту (eNOS). Наличие такого функционального комплекса показывает, что продукцию N0 в ЭК можно регулировать не только через регуляцию активности eNOS, но и через регуляцию активности САТ-1 переносчика.

Было также показано, что функциональный комплекс "САТ-1- eNOS" локализуется, главным образом, в кавелиях ЭК. Кавелии представляют собой специализированные микродомены плазматической мембраны, названные по присутствующим в них структурным белкам - кавелинам, и содержащие высокие концентрации холестерина и сфинголипидов и низкие концентрации фосфолипидов. Кавелин функционирует как белок-платформа, взаимодействуя с различными сигнальными молекулами, включая молекулы, функционирующие через G-белки, липидные сигнальные молекулы, кальций-зависимые сигнальные белки, компоненты МАР-киназных и тирозин-киназных путей. Взаимодействие кавелина с сигнальными молекулами обеспечивает их локализацию внутри кавелий. При поиске сигнальных путей, регулирующих САТ-1 мы выдвинули гипотезу, что локализация САТ-1 переносчика в кавелиях делает возможным его регуляцию через некоторые из этих путей. Для активации сигнальных каскадов в ЭК мы использовали коклюшный токсин (КТ), который способен стимулировать различные сигнальные каскады в кавелиях. Поставленная цель нахождения сигнальных путей, регулирующих транспорт аргинина вызвала необходимость решения следующих задач:

1. Охарактеризовать действие коклюшного токсина (КТ) на транспорт аргинина в ЭК, опосредуемый переносчиком САТ-1.

Найти и охарактеризовать сигнальные пути, по которым КТ воздействует на регуляцию активности САТ-1.

Выяснить на каком уровне - транскрипции, трансляции или посттрансляционной модификации - эти сигнальные пути регулируют функцию САТ-1.

Охарактеризовать продукцию N0 и установить характер зависимости между N0 продукцией и активностью САТ-1 переносчика при действии КТ на ЭК.

CAT - семейство переносчиков L-аргинина у млекопитающих

У большинства животных аргинин рассматривается полунезаменимой АК, что отражает тот факт, что синтеза аргинина de novo не всегда достаточно, особенно в условиях повышенной потребности, например при росте, заживлении ран (Reyes et al., 1994). L-аргинин вовлечен в синтез белков, креатина, мочевины, агматина и полиаминов, модулирует доставку гормонов и синтез пиримидиновых оснований (Reyes et al., 1994). Аргинин может синтезироваться из орнитина через цитруллин с помощью ферментов цикла мочевины (Hecker et al, 1990). Орнитин образуется из аргинина при действии аргиназ, но также может синтезироваться из глютамата и пролина (Wu and Morris, 1998). Аргинин, синтезируемый в печени там же и метаболизируется и, таким образом, не вносит значительного вклада в уровень аргинина в плазме крови. Аргинин в основном поступает в плазму крови из пищи (1-2 г/день) и из почек, где синтезируется. В других органах синтеза аргинина de novo практически не происходит и аргинин в клетках образуется при деградации белков или рециклизации цитруллина. Также аргинин поступает в клетки из экстраклеточного пространства (Closs and Mann, 2000b). Плазматическая мембрана непроницаема для таких полярных молекул как аминокислоты, сахара, нуклеотиды, за их перенос через мембрану отвечают специализированные переносчики. Специфические транспортные системы для различных аминокислот были описаны еще много лет назад на основе кинетических характеристик. Слово "система" подчеркивает, что за специфическую транспортную активность ответственней не один белок, а комплекс различных белков (Malandro and Kilberg; 1996, Deves and Boyd, 1998). В переносе аргинина и других катионных аминокислот могут участвовать 6 различных транспортных систем : у+, bi+, D2+, y+L, В + и b + (Closs and Mann, 2000b). Пять из них являются Na+-независимыми и одна - В + осуществляет перенос катионных аминокислот только в присутствии ионов Na+. Эти транспортные системы экспрессируются в различной степени в различных тканях, но только система у+ распространена практически повсеместно, за исключением печени. Мы не будем подробно останавливаться на описании всех транспортных систем, так как в объекте нашего исследования, эндотелиальных клетках, 75-90% транспорта аргинина осуществляется представителем у+ системы, белком-переносчиком, называемым САТ-1. Интересна история открытия САТ-1 белка, который к тому же был первым клонированным аминокислотным переносчиком животных.

Он был клонирован в 1989г. как мышиный рецептор, ответственный за инфекцию экотропным лейкемийным вирусом мышей (Albritton et al, 1989). В1991 г две независимых группы (Kim J.W. et al 1991; Wang et al,1991 ) показали, что рецептор экотропного ретровируса (EcoR) мышей обладает свойствами переносчика катионных аминокислот: L-аргинина, L-лизина и L-орнитина. Это свойство было обнаружено на основании сходства аминокислотной последовательности EcoR рецептора с аргининовыми и гистидиновыми пермеазами Saccharomyces cerevisiae. Транспортная функция была подтверждена в экспериментах, когда Xenopus ооциты, в которые была инъецирована EcoR кРНК проявляли значительно более высокую скорость транспорта катионных аминокислот. Транспортные свойства рецептора соответствовали хорошо изученной транспортной системе у+: основному переносчику катионных аминокислот (АК) в клетках млекопитающих. Эта система характеризуется высоко-афинным Na+- независимым транспортом катионных АК (Кт в микромолярных пределах) и транспортом цвитерионных аминокислот с низкой афинностью только в присутствии ионов Na (Кт в миллимолярных пределах); эта система является электрогенной и накопление субстрата связано с потенциалом плазматической мембраны; кроме того, у+ система устойчива к изменениям рН и чувствительна к стимуляции субстратом с транс-стороны мембраны (Palacin et al, 1998). Рецептор получил название катионный аминокислотный транспортер-1 мыши (тСАТ-1). Позже был клонирован человеческий аналог - hCAT-1 из 629 АК с молекулярной массой 68 кДА, который, как оказалось, не способен связывать экотропный ретровирус. Аминокислотное сходство САТ-1 мыши и человека составляет 88%. кДНК крысы кодирует 624 АК и на 97% сходна с мСАТ-1 (Puppi and Henning, 1995; Malandro and Kilberg, 1996). Клонирование второго члена семейства CAT переносчиков также произошло при решении задач, не имеющих отношения к транспорту аминокислот. МакЛеод и соавт. исследовали гены Т-клеток, участвующие в формировании опухолей у мышей (MacLeod et al, 1990а). С помощью вычитающей гибридизации они экспрессировали несколько кДНК генов с высокой степенью экспрессии в опухолеобразующей клеточной линии мышиной Т-лимфомы (SL12.4) и практически не экспрессирующихся в неинвазивных контрольных клетках. Одна из этих кДНК кодировала белок с аминокислотной последовательностью гомологичной только одному белку - САТ-1 (MacLeod et al, 1990b). Позже та же группа описала полную аминокислотную последовательность белка из 658 АК, имеющего 12 предполагаемых трансмембранных доменов и схожую с мСАТ-1 на 61% (Reizer et al, 1993). Белок получил название САТ- 2 (иногда в литературе упоминается как САТ-2В). Изучение транспортных свойств САТ-2 при инъекции кРНК в ооциты показало, что также, как и САТ-1, САТ-2 увеличивает захват катионных аминокислот по сравнению с контрольными ооцитами. Транспорт, опосредованный САТ-2 к РНК, был насыщаем, Na+- независимым и с Км примерно 150-250мкМ (Kakuda et al, 1993). Используя часть САТ-2 последовательности, Каннингхам и соавт. (Closs et al, 1993b) клонировали третий член CAT семейства из печени мыши, получивший название САТ-2А. САТ-2 и САТ-2А гомологичны на 97% и происходят из одного гена благодаря альтернативному сплайсингу. Однако, САТ-2А кРНК, инъецированная в ооциты, вызывала захват аргинина с Км на порядок выше по сравнению с САТ-1 и САТ-2. Скрининг кДНК библиотеки из мозга крысы с помощью мСАТ-1 зонда привел к идентификации еще одного члена САТ-семейства, получившего название САТ-3, чья экспрессия у взрослых животных ограничена мозгом (Hosokawa et al, 1997). Продуктом гена является белок из 619 АК с молекулярной массой 67кДА. САТ-3 проявляет 53-58% гомологии с другими членами CAT семейства. Временная экспрессия САТ-3 в COS-7 клетках приводила к индукции активности у+ транспортной системы с Км для аргинина ЮЗмкМ.

Совсем недавно был обнаружен еще один член семейства CAT - САТ-4 (Wolf et al, 2002), клонированный из человеческой плаценты и на 59-61% сходный с другими членами семейства CAT. Однако, у САТ-4 не удалось обнаружить транспортных свойств. 2.2 Структура и тканевое распространение переносчиков CAT семейства: Согласуясь с характеристиками у+ транспортной системы САТ-1 распространен по всем тканям за исключением печени взрослых, хотя уровень экспрессии варьирует в различных типах тканей (Closs et al, 1993b, Verrey et al, 2003). При некоторых воздействиях САТ-1 может начать экспрессироваться и в печени, например, в ответ на инсулин, глюкокортикоиды, частичную гепатектомию (Aulak et al, 1996), а также в клетках гепатомы (Woodard et al, 1994). САТ-1 считается основным представителем транспортной системы у+ в большинстве типах клеток. Гомозиготные knockout CAT-Г мыши рождались с размером на 25% меньше чем контрольные мыши, с резко выраженной анемией и нарушениями в почках, и умирали в первый же день рождения (Perkins et al, 1997). Относительно нормальное развитие большинства тканей в трансгенных мышах с нокаутным САТ-1 до рождения, возможно, обусловлено экспрессией САТ-3 в течение эмбриогенеза (Nicholson et al, 1998). мСАТ-1 состоит из 622 аминокислот с вычисленной молекулярной массой 67 кДа. На основе анализа аминокислотной последовательности было предположено, что САТ-1 содержит 14 трансмембранных доменов (Albritton et al, 1989; Deves R and Boyd, 1998; Woodard et al, 1994), при этом N-конец расположен в цитоплазме, так как на нем отсутствует сигнальная последовательность (рис.4). САТ-1 гликозилируется по двум сайтам Asn-223 и Asn-229 в третьей экстраклеточной петле (Yoshimoto et al, 1993). Мутации в сайтах гликозилирования мСАТ-1 не изменяли транспортных свойств мСАТ-1, однако, значительно повышали чувствительность клеток к экотропному леикемииному ретровирусу мыши.

Обеспечение NO-синтазы субстратом как фактор регуляции продукции N0

Нормальное функционирование сосудов нарушается при многих заболеваниях. Повышенное содержание холестерина в крови, атеросклероз, ишемия, гипертензия, курение, диабет приводят к дисфункции сосудов (Arnal et al, 1999). Например, повышенное содержание холестерина в крови у кроликов приводило к повышенной чувствительности сосудов к вазоконстрикторам и в то же время к ослаблению способности ацетилхолина расслаблять сосуды (Rossitch et al, 1991). С открытием NO как физиологического регулятора давления сосудов возникла идея проверить, способен ли аргинин, предшественник NO в организме, восстанавливать нарушенные функции сосудов. Было проведено огромное количество исследований, использующих аргинин как пищевую добавку (Clarkson et al, 1996), внутривенную инъекцию (Drexler et al, 1991; Creager et al, 1992) в экспериментах in vivo или как добавку к среде инкубации сосудов в экспериментах in vitro (Rossitch et al, 1991; Simmons et al, 1996). Эти исследования показали, что аргинин восстанавливает эндотелий-зависимые функции сосудов: вызывает периферическую вазодиляцию, ингибирует аггрегацию тормбоцитов. Добавление аргинина в пищу уменьшает адгезию макрофагов и предотвращает атеросклероз (Vallance and Hingorani, 1999). Эти эффекты аргинина, повидимому, связаны с NO-синтазными путями, так как уровень нитратов плазмы и cGMP в моче увеличивается в течение поступления аргинина. Снижение экспрессии САТ-1 переносчика в капиллярах мозгового слоя почек крыс с помощью антисмысловых олигонуклеотидов приводило к снижению N0 продукции и повышению кровяного давления (Kakoki et al, 2002). При атеросклерозе или при обработке бычьих эндотелиальных клеток аорты лизофосфатидилхолином, что является моделью атеросклероза in vitro, резко уменьшалась высоко-афинная компонента транспорта аргинина, опосредованная САТ-1 переносчиком, что приводило к снижению в продукции NO (Kikuta et al, 1998). Добавление в среду избыточного аргинина приводило к восстановлению продукции N0 за счет поступления аргинина в клетку через низко-афинную компоненту транспорта аргинина. Таким образом, в данных экспериментах, моделирующих атеросклероз, уменьшенная продукция N0 была вызвана исключительно уменьшением доступности экстраклеточнго аргинина. В клетках сердечной мышцы (кардиомиоциты), совместное действие цитокинов интерлейкина -ір и интерферона у приводило к увеличению экспрессии индуцибельной NOS, и, соответственно, к увеличению продукции N0 (Simmons et al, 1996). Добавление в среду лизина, конкурентного антагониста транспорта аргинина ингибировало вызванную цитокинами продукцию N0 на 70% , указывая на зависимость NO-продукции от транспорта аргинина. Корреляция в активации eNOS и аргининового транспорта была обнаружена при моделировании воздействия на сосуды кровяного давления (Posch et al, 1999). Суммируя все выше приведенные данные можно сделать вывод, что доставка аргинина в клетку лимитирует скорость NO-синтазной активности.

Измерения концентраций аргинина внутри клеток и в циркулирующей среде обнаружили удивительный факт. Тогда как концентрация циркулирующего аргинина обычно 50-200 мкМ (Wu and Morris, 1998), уровень внутриклеточного аргинина в эндотелиальных клетках порядка 800 мкМ и выше (Block et al, 1995), то есть внутри клеток аргинина содержится гораздо больше чем во внеклеточной среде. В то же время для eNOS Km = З мкМ, на два порядка ниже внутриклеточной концентрации аргинина. Казалось бы внутриклеточный аргинин полностью обеспечивает NOS субстратом и ее активность не должна зависить от изменений в экстраклеточном аргинине. Однако, приведенные выше примеры показывают, что NO-продукция может быть увеличена с помощью экстраклеточного аргинина. Более того, Арнал и соавт. (Arnal et al, 1995) демонстрируют, что внутриклеточные концентрации аргинина в эндотелиальных клетках могут могут варьироваться более чем в сто раз без изменений в продукции N0. Увеличение продукции N0 при повышении концентрации экстраклеточного аргинина, не смотря на достаточно высокие внутриклеточные концентрации аргинина, получило название "аргининого парадокса" ( Forstermann et al,1994; Kurz and Harrison, 1997). Для объяснения эффекта "аргининого парадокса" было предложено несколько гипотез. Одна из первых гипотез была основана на предположении, что внутриклеточный аргинин может локализоваться в клетке в одном или нескольких пулах, плохо доступных или совсем недоступных eNOS, при этом экстраклеточный аргинин, транспортируемый в клетку, непосредственно доставляется к eNOS (McDonald et al, 1997). В соответствии с этой гипотезой переносчик аргинина должен находиться в непосредственной близости или быть связанным с eNOS. С помощью конфокальной микроскопии авторы показали колокализацию в эндотелиальных клетках аорты свиньи кавеолина, eNOS и САТ-1. Более того, они показали, что инкубация солюбилизирован-ных белков плазматических мембран с антителами к eNOS приводит к значительному уменьшению транспорта аргинина в рекоституированных липосомах, тогда как транспорт глютамина при этом не изменяется. Таким образом, эти результаты демонстрируют наличие физического комплекса между eNOS и САТ-1, находящегося в кавелиях. К сожалению отсутствие антител, работающих в иммунопреципитации не позволило авторам напрямую показать наличие такого комплекса. Однако, позже коиммунопреципитация кавелина и мСАТ-1 была показана в ВНК клеточной линии, трансфицированной химерной конструкцией мСАТ-1 с GFP на С-конце (Lu and Silver, 2000). Это подтверждает существование комплекса между САТ-1 и eNOS, которая также находится в ассоциации с кавеолином (Garcia-Gardena G et al, 1996, 1997). Вторая часть гипотезы о нахождении внутриклеточного аргинина в пулах, недоступных или слабо доступных NOS была подтверждена в работах Клосс и соавторов (Closs et al, 2000а). Они исследовали важность переносчиков семейства CAT в поставке аргинина NO-синтазам в макрофагах мыши J774A.1 и эндотелиальных клетках человека EA.hy926. САТ-1 переносчик экспрессировался в обоих типах клеток, САТ-2В - только в активированных макрофагах. Было показано, что в этих типах клеток существует аргининовый пул, легко обменивающий аргинин с экстраклеточным аргинином (названный пулом 1). Истощение этого пула инкубацией в 2 мМ лизине, конкурентной для транспорта аргинина аминокислоте, приводило к уменьшению внутриклеточного аргинина с 2 мМ до 160 мкМ для активированных макрофагов и с 3.5 мМ до 600 мкМ в эндотелиальных клетках.

Однако, даже длительная инкубация клеток в лизине не могла полностью истощить внутриклеточный пул аргинина. Было предположено, существование второго пула внутриклеточного аргинина, который не может свободно обмениваться с экстраклеточным аргинином (названный пулом 2). Резкое уменьшение N0 синтеза в макрофагах после инкубации в 2 мМ лизине, указывает на то, что iNOS не имеет доступа к аргинину второго пула. В то же время, iNOS имеет доступ к первому пулу, так как N0 синтез не изменялся в макрофагах, преинкубированных в аргинин - содержащей среде, но не имеющих доступа к экстраклеточнуму аргинину в течении анализа продукции N0. В эндотелиальных клетках N0 синтез не менялся после инкубации клеток в лизине (2 мМ, до 24 ч), что указывает на доступ eNOS ко второму пулу. Авторы делают вывод, что САТ-опосредованный транспорт экстраклеточного аргинина играет более важную роль в снабжении субстратом iNOS в макрофагах, нежели для eNOS в эндотелиальных клетках, которой достаточно внутриклеточного пула. Согласуя свои данные с хорошо известными фактами о том, что при многих патологических состояниях экстраклеточный аргинин восстанавлиает нарушенную продукцию N0, авторы предполагают, что патофизиологические состояния нарушают доступ eNOS к внутреннему пулу 2, и в этих условиях экстраклеточный аргинин может регулировать NO-продукцию. Не все исследователи находили этот эффект экстраклеточного аргинина на NO-продукцию. Например, в эндотелиальных клетках скорость аргининового транспорта не кореллировала со стимулированной Са-ионофором А23187 активностью eNOS (Closs et al, 2000a; Schmidt et al, 1993). В то же время другим авторам удалось обнаружить корреляцию в активации NO-продукции и аргининового транспорта в бычьих эндотелиальных клетках, стимулированных А23187 (Hardy and May, 2002). Было предложено еще несколько гипотез, объясняющих "аргининовый парадокс", однако, дальнейшего подверждения этих гипотез пока в литературе нет.

Повышение продукции N0 в КТ-обработанных клетках

Параллельно с изучением путей действия КТ на транспорт аргинина нас интересовало, что происходит с продукцией N0 в ЭК. Действительно ли в соответствии с теорией "аргининового парадокса" повышение в скорости захвата аргинина клетками приведет к повышению продукции N0? Измерение продукции NO клетками напрямую связано с определенными трудностями, вызванными короткой жизнью NO (хі/2 3-6сек), и его диффузностью. Поэтому были разработаны опосредованные методы измерения N0: по накоплению нитритов, стабильного продукта утилизации N0; по образованию цитруллина из аргинина, по образованию метаглобина из оксигемоглобина и по образованию цГМФ в клетках-мишенях (Nagano 1999, Patel et al, 1995, Ramasamy et al, 1998). Мы использовали два метода для определения N0 после обработки клеток КТ. В первом методе определялась продукция N0 с помощью измерения интенсивности флюоресценции флюоресцентного зонда на NO DAF-FM с использованием конфокального микроскопа. Разработанный несколько лет назад новый специфичный индикатор окиси азота DAF-FM дает возможность напрямую измерять продукцию N0 с высокой чувствительностью и стабильностью результатов (Kojima et al, 1998, 1999). В отличие от ранее используемого DAF-2, флюоресценция DAF-FM не зависит от изменений рН, что удобно при сравнении контрольных и обработанных клеток, когда не нужно учитывать влияние возможных изменений рН на флюоресценцию зонда (Itoh et al, 2000). С помощью этого метода мы показали, что NO продукция значительно возрастает в клетках, обработанных КТ (рис.14). Как показано на рис.14 в ЭК, обработанных КТ, продукция N0 в 2 раза выше по сравнению с контролем. РМА, добавленное к клеткам, обработанных КТ, снимает эффекты КТ на N0 продукцию (рис.14). Таким образом, мы видим, что РМА восстанавливает как транспорт аргинина, так и N0 продукцию, измененные при обработке ЭК КТ. Кроме того, эти данные указывают на то, что поступление экстраклеточного аргинина в клетку является регуляторным фактором в продукции N0, так как изменения в N0 продукции кореллируют с изменениями в транспорте аргинина. Чтобы подтвердить результаты, полученные с помощью изображения N0-вызванной флюоресценции, мы использовали второй метод определения продукции N0 по образованию [3Н]-Ь-цитруллина из экстраклеточного [3Н]-Ь-аргинина, захваченного клетками. Как известно, при каталитическом действии N0S из L-аргинина образуется N0 и L-цитруллин в соотношении 1:1.

Поэтому о продукции N0 можно судить по образованию [3Н]-Ь-цитруллина из поступившего в клетку У экстраклеточного [ ITJ-L-аргинина. Данный метод позволяет оценить не только изменения в продукции N0, но также и изменения в активности eNOS. На рис.15 представлены результаты измерения продукции цитруллина. Обработка ЭК КТ (500 нг/мл, 18 ч) приводила к увеличению продукции [3Н]-Ь-цитруллина примерно на 230% (рис. 15А). Теоретически увеличенная продукция N0 может быть вызвана двумя причинами: за счет активации eNOS и за счет увеличения концентрации аргинина, являющимся субстратом eNOS. При концентрациях субстрата, далеких от насыщения, скорость продукции N0 будет пропорциональна концентрации субстрата при неизменной активности eNOS. Известно, что повышение экстраклеточного аргинина в пределах 0-200 мкМ приводит к повышению образования N0, откуда, можно считать, что в данных условиях eNOS работает при концентрациях субстрата далеких от насыщения. В этом случае процент аргинина, превращающегося в цитруллин может служить мерой активности eNOS. Измерения доли [3Н]-Ь-аргинина, превращаемого в [3Н]-Ь-цитруллин, показали, что длительная обработка КТ не изменяет eNOS активности в ЭК (рис. 15В). Чтобы подтвердить сделанный нами вывод, мы проверили активность eNOS на изолированных мембранах из контрольных и КТ-обработанных клеток. Этот метод дает точную оценку активности eNOS, так как анализ проводится при фиксированных концентрациях субстрата и кофакторов, в отличие от измерения eNOS активности в интактных клетках, где о концентрации субстрата мы имеем лишь косвенные данные. Как показано на рис. 16, длительная обработка ЭК КТ не изменяет активности eNOS в мембранных препаратах. Это свидетельствует о том, что повышение NO продукции под действием КТ обусловлено активацией транспорта аргинина, а не активацией eNOS. Так как цитруллин может образовываться в клетке не только при ферментативном действии NOS, но и при других процессах, например из орнитина, мы провели дополнительные эксперименты, доказывающие, что повышенная продукция цитруллина при обработке ЭК КТ вызвана действием eNOS. Для этого мы использовали конкурентный ингибитор NOS -метиловый эфир №-нитро-Ь-аргинина (L-NAME), который является производным L-аргинина. Однако, в отличие от L-аргинина, L-NAME - нейтрально заряженная молекула, поэтому его доставка в клетку осуществляется другими транспортными системами, чем доставка аргинина. Действительно, на рис. 15Б мы видим, что L-NAME не влияет на скорость захвата клетками L-аргинина из экстраклеточной среды. В то же время L-NAME блокировал выработку [ Н]-Ь-цитруллина почти на 70%, как в контрольных так и КТ-обработанных клетках, подтверждая тем самым, что образование [3Н]-Ь-цитруллина в ЭК, главным образом, обусловлено работой eNOS (рис15Аи 16). Помимо проверки источника продукции цитруллина при действии КТ, в эксперименты с L-NAME была заложена проверка еще одной идеи. Совсем недавно в литературе появились данные, что в некоторых клеточных системах активация транспорта аргинина снимается ингибиторами NO синтеза. Так, в макрофагах, активация транспорта аргинина, вызванная липополисахаридами (ЛПС), полностью снималась АМТ, специфическим ингибитором iNOS (Hammermann et al, 2001). В клеточной линии эндотелиальных клеток HUVEC, повышенная скорость транспорта аргинина, вызванная высокими концентрациями глюкозы возвращалась к норме при обработке L-NAME, ингибитором синтеза NO (Flores et al, 2003). Таким образом, в этих статьях разрабатывается теория обратной связи между активностью NOS и транспортом аргинина.

Предполагается, что не только изменения в транспорте аргинина способны регулировать скорость продукции NO, но и изменения в продукции N0, в свою очередь, могут регулировать скорость захвата аргинина. Наши данные не подтвердили эту гипотезу для ЭК, так как в наших экспериментах L-NAME не был способен отменить активацию аргининового захвата, вызванную действием КТ (рис. 15Б). В отличие от ЭК, на которых проведены наши эксперименты, макрофаги и HUVEC помимо САТ-1 экспрессируют также переносчик аргинина САТ-2В. По-видимому, именно присутствие САТ-2В в макрофагах и HUVEC объясняет наличие обратной связи между продукцией NO и транспортом аргинина в этих клетках. В то же время, отсутствие САТ-2В переносчика в ЭК объясняет отсутствие регуляции транспорта аргинина NO в ЭК легочной аорты свиньи. САТ-2В рассматривается как индуцибельная форма семейства CAT, то есть его экспрессия кореллирует с экспрессией iNOS. Активность iNOS намного выше eNOS и отсутствие субстрата при активной iNOS может привести к образованию токсичных радикалов кислорода в высоких концентрациях. Регуляция САТ-2В с помощью NO может быть одним из механизмов предотвращения недостатока в субстрате. САТ-1, по-видимому, имеет отличный от САТ-2В способ регуляции, что объясняет отсутствие эффектов L-NAME на КТ-вызванную активацию транспорта аргинина. КТ действует на транспорт аргинина через снижение активности классических изоформ ПКС. Однако, это не значит, что ПКС может участвовать в изменениях транспорта аргинина при других процессах. Может ли РМА нормализовать транспорт аргинина, повышенный при других воздействиях? Чтобы ответить на этот вопрос мы 1ч восстановления после обработки ЛПС Рис. 17 Восстановление транспорта аргинина с помощью РМА после различных обработок. ЭК обрабатывались: А - раствором сигаретного экстракта (СЭ) или Б - 100 мкг/мл ЛПС в течение 24 ч. После этого, клетки промывались и к части клеток добавлялось РМА в концентрации 100 нМ еще на 1 час. Р 0.01 относительно контроля, Р 0.05 относительно контроля и 0.01 относительно восстановления без РМА.

Идентификация ПКС изоформ, участвующих в регуляции транспорта аргинина в ЭК.

Убедившись, что РМА может модулировать изменения в транспорте аргинина, вызванные различными воздействиями, мы решили подробнее изучить механизм действия РМА. Форболовый эфир РМА является активатором классических и новых изоформ протеин киназы С. Протеин киназы С- это большое семейство, по крайней мере, 11 родственных киназ, активируемых различными продуктами деградации фосфолипидов. Все изоформы ПКС поделены на три подсемейства: классические изоформы (a, pi, р2, у), активируются Са и диацилглицерином, новые изоформы (є, 5, 0, г], р.)- активируются только диацилглицерином (ДАГ), и атипичные изоформы (k, Q, которые не зависят ни от Са , ни от ДАГ. Кроме того, для каталитической активности всех изоформ ПКС необходим фосфатидилсерин (Nishizuka, 2001; Shirai and Saito, 2002). РМА действует на ПКС, имитируя действие ДАГ (Nishizuka, 2001). Наши результаты при поиске путей, регулирующих САТ-1 указывают на участие ПКС в регуляции транспорта аргинина. Кроме того, существуют теоретические предпосылки для участия ПКС в регуляции САТ-1. Во-первых, в пятом и шестом внутриклеточных участках САТ-1 содержит три теоретически возможных сайта фосфорилирования под действием ПКС. Во-вторых, САТ-1 локализуется в кавелиях и может связываться с кавелином. ПКС также имеет домен связывания с кавелином и при некоторых воздействиях перемещается в кавелии (Oka et al,1997). Колокализация САТ-1 и активированной ПКС в кавелиях делает возможным взаимодействие ПКС и САТ-1 при определенных физиологических состояниях или фармакологических обработках. Чтобы показать возможное участие ПКС в регуляции опосредованного переносчиком САТ-1 транспорта аргинина, мы обрабатывали эндотелиальные клетки РМА (форбол-12-миристат-13 -ацетат) - активатором классических и новых изоформ ПКС (кл и нПКС) и его неактивным аналогом 4а-форболом (4Р). Мы обнаружили, что эффекты РМА на транспорт аргинина зависели от времени обработки клеток: 1ч обработки РМА ингибировал транспорт аргинина на 30% (рис. 18А), тогда как длительная обработка (18 ч) активировала транспорт аргинина на 70% (рис. 18Б). Неактивный аналог 4а-форбол не изменял транспорт аргинина ни при коротких, ни при длительных временах обработки (рис. 18А и Б). Чтобы понять причину столь противоположного действия РМА на транспорт аргинина, а также выяснить какие именно изоформы ПКС ответственны за эффект РМА на транспорт аргинина, мы решили выяснить как обработка клеток РМА влияет на индивидуальные изоформы ПКС. Несмотря на то, что в клетке могут присутствовать несколько различных изоформ ПКС, их локализация, субстратная специфичность, механизмы активации и, соответственно, функции различаются (Newton, 1987; Shirai and Saito, 2002).

Таким образом, хотя РМА активирует несколько изоформ ПКС, за эффект РМА на транспорт аргинина может отвечать только одна из изоформ ПКС. Наши предварительные данные, основанные на результатах Вестерн-блота, показали, что в ЭК свиной аорты экспрессируются изоформы ПКСа, ПКСє, ТЖСУС,, ПКСц и в значительно меньшей степени ПКСр. Мы выбрали для анализа ПКСа (представитель классических изоформ ПКС), ПКСе (представитель новых изоформ ПКС) и ПКСУС, (атипичные изоформы ПКС). Как известно, при активации, ПКС изоформы изменяют место локализации, перемещаясь к новым клеточным сайтам, включающим плазматические мембраны, цитоскелетные элементы, ядра и др. компартменты клетки (Shirai and Saito, 2002). Впервые это свойство ПКС было отмечено Крафтом с соавт. (Kraft et al, 1982). Они показали, что если клетки тимомы обработать РМА, то ПКС переходит из цитозольной в так называемую нерастворимую фракцию (если клетки лизировать в буфере, не содержащем детергентов, и отцентрифугировать, то в осадке будут содержаться фракции различных мембран, цитоскелета, которые в литературе получили название нерастворимой фракции). Позже было показано перемещение ПКС изоформ из цитозольной в нерастворимую фракцию при различных физиологических и фармакологических стимулах (Dekker and Parker, 1994). Так как активация ПКС сопровождается ее перемещением внутри клеток, мы исследовали как изменения в транспорте аргинина, вызванные РМА, кореллируют с перераспределением ПКС изоформ и САТ-1 переносчика между растворимой (С) и нерастворимой (Р) фракциями эндотелиальных клеток. Мы параллельно изучали активность транспорта аргинина, и экспрессию и транслокацию ПКСа, ПКСє, и ПКСА/ при различных временах обработок клеток РМА. Клетки обрабатывались 100 нМ РМА в течении 10 мин., 1 ч, 4ч и 18 ч. Временная зависимость эффектов РМА на транспорт аргинина представлена на рис. 19А. Ингибиторный эффект проявлялся уже через 10 мин. обработки и через 4ч начинал исчезать, переходя в активирующий эффект к 18 ч (рис. 19А). Ингибиторный эффект РМА на транспорт аргинина сопровождался быстрым перемещением ПКСа из цитозольной в нерастворимую фракцию, тогда как активирующий эффект РМА на аргининовый транспорт сопровождался полным исчезновением ПКСа в экстрактах клеток, (рис. 19В). ПКСє, которая в контрольных клетках лишь частично расположена в цитозоле, при обработке РМА также полностью переходила в нерастворимую фракцию в течение первых 10 мин (рис. 19В). Однако, уменьшение ПКСє проходило намного медленнее, чем ПКСа при длительном действии РМА и РМА-вызванное изменение в транспорте аргинина в большей степени кореллировало с изменениями ПКСа, чем ПКСє. ПКСХУ , которые локализуются в основном в цитоплазме, не изменяли своего распределения между фракциями в течение всех времен обработок РМА (рис. 19В). Из этих данных можно предположить, что экспрессия ПКСа в нерастворимой фракции и опосредованный САТ-1 транспорт аргинина в эндотелиальных клетках свиньи взаимосвязаны: чем больше ПКСа локализуется в нерастворимой фракции тем ниже уровень транспорта аргинина.

В то же время было показано, что изменения в транспорте аргинина (рис.19А), вызванные обработкой РМА, не сопровождались перераспределением САТ-1 переносчика между растворимой и нерастворимой фракциями в течение всех времен обработок (рис. 19В) и большая часть САТ-1 белка находится в нерастворимой фракции, что соответствует его мембранной локализации. 4.2 Эффекты THY и PIP на транспорт аргинина. Чтобы уточнить какие именно ПКС изоформы ответственны за изменения в транспорте аргинина при действии РМА, мы использовали более специфичные активаторы ПКС - тимелеатоксин (THY), который селективно активирует Са-зависимые классические изоформы ПКС, и фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат-дипальмитоил (PIP), который активирует Са-нечуствительные, новые изоформы ПКС. THY выделен из листьев египетского растения Thymelea hyrsuta, и является производным форболового эфира (Evans et al, 1991). Как показали эксперименты на очищенных препаратах различных изоформ ПКС (Evans et al, 1991; Llosas et al, 1996), a также эксперименты на клеточных культурах (Yanagita, et al 2000; Asada et al, 1998), THY активирует только классические изоформы ПКС при концентрациях 100 нМ и ниже. PIP является синтетическим аналогом фосфатидилинозитолтрифосфатов (PI-3-Р), которые образуются при фосфорилировании инозитольных липидов мембраны под действием фермента фосфатидилинозитид 3-киназы (PI-3 киназа). PIP является активаторым новых ПКС изоформ и не изменяет активности классических ПКС изоформ в экспериментах как in vitro так, и in vivo (Toker et al, 1994; Derman et al, 1997). Как показано на рис.20, THY (100 нМ) вызывал такие же изменения в транспорте аргинина как и РМА (100 нМ): уменьшал захват аргинина клетками через 1 ч обработки и увеличивал захват аргинина через 18 ч обработки. В отличие от РМА и THY, PIP (5 мкМ) не действовал на транспорт аргинина ни через 1 ч, ни через 18 ч обработки (рис.20). Изучение перераспределения изоформ ПКС по клеточным фракциям подтвердило специфичность THY и PIP (рис. 21 A). THY вызывал транслокацию ПКСа и не действовал на ПКСє и UKCk/C,. PIP, наоборот, вызывал транслокацию только ПКСє, не изменяя распределения по фракциям других изоформ (рис. 21 А). Как и РМА, THY при длительной обработке ЭК (100 нМ, 18 ч), вызывал полное истощение внутриклеточного пула ПКСа (рис. 21 Б). Таким образом, селективный активатор классических изоформ ПКС полностью имитировал эффекты РМА на транспорт аргинина в ЭК. Более того, эффекты кратковременного действия РМА и THY на транспорт аргинина снимались предобработкой клеток селективным ингибитором Са-зависимых ПКС изоформ - Go 6976 (1 мкМ), который не влияет на

Похожие диссертации на Сигнальные пути регуляции аргининового транспорта в эндотелиальных клетках