Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Фотодинамическая терапия (ФДТ) 8
1.1.1. История фотодинамической терапии 8
1.1.2. Типы фотодинамических реакций 9
1.1.3. Фотодинамическая терапия 12
1.1.4. Механизмы повреждения опухолевой ткани при проведении ФДТ 14
1.2. Фотосенсибилизаторы (ФС) 16
1.3. Структура и фотофизические свойства порфиринов 18
1.4. Внутриклеточная локализация ФС 19
1.5. Клеточные эффекты при фотодинамическом воздействии 22
1.6. Фотосенсибилизированный гемолиз эритроцитов человека 25
1.7. Иммунно-регуляторные эффекты ФДТ 28
1.8. Современные представления о механизмах развития реакции контактной чувствительности (КЧ) 30
Глава 2. Материалы и методы 36
Глава 3. Результаты и обсуждение 48
3.1. Сравнение темновых и фотогемолитических эффектов производных дейтеропорфиринаІХ (ДП)
3.2. Определение прочности связывания производных ДП с эритроцитами человека 58
3.3. Сравнение темновых и фотогемолитических эффектов
протопорфиринаІХ (ППІХ) и его фотопродуктов 66
Определение и сравнение темновых и фотогемолитических эффектов АФ1иАФ2 73
Влияние боковых заместителей на темновые и фотогемолитические эффекты производных ППІХ 79
3.4. Влияние фотопродуктов ППІХ на реакцию КЧ у мышей 81
3.4.1. Супрессорное действие предоблученного ППІХ и его фотопродуктов - фотопротопорфирина 1 (ФПП1) и фотопротопорфирина 2 (ФПП2) на реакцию КЧ к ДНФБ 82
3.4.2. Иммунные механизмы супрессорного действия ФПП1 на КЧ 88
Действие ФПП1 на разные фазы развития КЧ 88
Угнетение функций эффекторов КЧ и активация клеток с супрессорным потенциалом 91
Выводы 102
Список литературы
- Типы фотодинамических реакций
- Структура и фотофизические свойства порфиринов
- Определение прочности связывания производных ДП с эритроцитами человека
- Угнетение функций эффекторов КЧ и активация клеток с супрессорным потенциалом
Введение к работе
Фотодинамическая терапия (ФДТ) - современный метод лечения ряда онкологических и неонкологических заболеваний, основанный на воздействии света на ткани, содержащие фотосенсибилизатор (ФС) [Dougherty, 2002; Wilson, 2002; Collaud et al., 2004]. Метод заключается в следующем: пациенту однократно вводят ФС, молекулы которого избирательно накапливаются в опухолевых тканях, повышая их чувствительность к свету. Спустя некоторое время ткани, содержащие ФС, облучают светом, что инициирует фотобиологические процессы, приводящие к разрушению опухоли, ее рассасыванию и замещению соединительной тканью [Wilson, 2002].
Повреждение опухолевой ткани при проведении ФДТ происходит по нескольким направлениям: 1) эффекты, приводящие к непосредственной гибели клеток через некроз или апоптоз; 2) изменения в кровоснабжении опухолевой ткани, приводящие к ее ишемии; 3) иммунный ответ организма вследствие разрушения опухоли [Korbelik, 1996; Oleinik, Evans, 1998; Henderson, Dougherty, 1992; Dougherty T.J., 2002; Wilson B.C., 2002].
Предполагают, что терапевтический эффект ФДТ является следствием протекания фотодинамических (ФД) (кислород-зависимых) реакций ФС и главным повреждающим агентом является синглетный килород (!02) [Henderson, Dougherty, 1992]. В живых клетках диффузионная длина пробега 'Ог мала и сопоставима с толщиной мембраны, и он преимущественно дезактивируется в непосредственной близости от места его генерации [Kanofsky, 1991; Moan, Berg, 1991; Krasnovsky, 1998]. '02 повреждает биоструктуры в непосредственной близости от молекул ФС. Поэтому, повреждающее действие ФДТ во многом определяется локализацией ФС в клетке.
Известно, что способность ФС проникать в клетку и его внутриклеточная локализация ФС зависят от размеров молекулы ФС, полярности, способности к агрегации, распределения заряженных групп в
молекуле и др. [Соболев и др., 2004; Berg et al., 1994; Boyle, Dolphin, 1996; Ruck, Diddens, 1996].
Селективность внутриклеточного распределения ФС не абсолютна, что предполагает существование множества внутриклеточных мишеней для ФД воздействия: мембраны клеток (плазматические, митохондриальные, ядерные и т.д.), митохондрии, лизосомы и эндосомы, эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольджи, ядро. При этом трудно выделить какую-либо одну критическую мишень, модификация которой ведет к гибели клетки. Считают, что терапевтический эффект ФДТ является следствием фотосенсибилизированного повреждения различных клеточных мишеней [Jori, 1996; Morgan, Oseroff, 2001].
Наиболее широко в ФДТ используются соединения порфиринового ряда - различные порфирины, хлорины, фталоцианины и т.д. [Kessel, 1997; Dougherty et al., 1998; Hasan et al., 2000; Zane, 2001; Moan, Peng, 2003]. Однако, идет поиск новых наиболее эффективных ФС для ФДТ. Требованиями к новым ФС являются: селективное и быстрое накопление опухолями; отсутствие темновой токсичности; высокий квантовый выход генерации синглетного кислорода; высокий квантовый выход триплетных состояний; наличие максимума поглощения в длинноволновой области видимого излучения и т.д. [Moan, 1990; Penning, Dubbelman, 1994; Jori, 1996; Joham, 1998].
Одной из клеточных мишеней при ФД воздействии является плазматическая мембрана клетки [Dougherty et al., 1998]. В этой связи, скрининг биологической активности новых ФС для ФДТ может быть проведен по их мембранотоксическим свойствам. Поэтому выявление связи структура ФС-мембранотоксичность является актуальной задачей.
Удобной и широко используемой моделью оценки мембранотоксических свойств ФС, применяемых в ФДТ является фотосенсибилизированный гемолиз эритроцитов человека [Kaestner et al., 2004].
Известно, что ФДТ с такими красителями, как порфирины и хлорины, часто сопровождается угнетением Т-клеточного иммунитета [Simkin G.O. et al. 1997; Simkin G.O et al., 2000, Musser D A. and Oseroff A..R., 2001; Nowis et al., 2005]. ФДТ-индуцированная иммуносупрессия может быть основным механизмом терапевтических эффектов при неонкологических заболеваниях. Например, обнаружено, что ФДТ может успешно использоваться для лечения ряда кожных и аутоиммунных заболеваний [Kurwa and Barlow, 1999]. Фотохимический механизм супрессии при ФДТ не известен. Одним из ФС, используемых в ФДТ является протопорфирин IX (ПШХ) [Sternberg et al., 1998]. В ходе проведения ФДТ происходит фотолиз ПШХ с образованием его стабильных фотопродуктов [Сох and Written, 1982; Wessels et al., 1993], которые можно обнаружить как в растворах, так и в клетках [Bagdonas et al., 2000; Juzenas et al., 2001; Theodossiou and MacRobert, 2002]. В литературе нет данных о том, могут ли стабильные фотопродукты ПШХ вносить вклад в супрессорное действие ФДТ. В этой связи изучение эффектов фотопродуктов ПШХ на Т-клеточный иммунный ответ in vivo также является актуальным.
Цель настоящей работы:
сравнить гемолитическую и иммуносупрессорную активность производных дейтеропорфирина IX (ДП), протопорфирина IX (ППІХ) и его фотопродуктов и порфиринов, содержащих аминофосфонатную группу.
Задачи исследования:
1. Сравнить темновые и фотогемолитические эффекты производных ДП
и определить прочность связывания данных соединений с мембраной
эритроцита.
Оценить темновые и фотогемолитические эффекты ПШХ и его фотопродуктов, а также порфиринов, содержащих аминофосфонатную группу.
Изучить влияние фотопродуктов ПШХ на Г-клеточный иммунный ответ in vivo в модели реакции контактной чувствительности у мышей.
Типы фотодинамических реакций
Фотодинамический эффект был открыт в 1900 г. О. Раабом, аспирантом известного биолога Г. Таппайнера. Суть его состоит в том, что окрашенные акридином, эозином и другими красителями клетки парамеции теряют подвижность и гибнут, и токсичность красителей зависит от освещения. Таппайнер предложил термин "фотодинамический эффект". В 1902 г. Ledoux-Lebards показал, что для фотодинамического (ФД) повреждения необходим кислород. Таким образом, для ФД повреждения клеток необходимы три компонента: краситель (фотосенсибилизатор), химическое соединение, повышающее чувствительность биологических объектов к свету, свет и кислород. В 1902 г. Dreyer открыл бактерицидное действие света на окрашенные бактерии. Таппейнер в 1903 г. провел успешные опыт ы по ФД терапии заболеваний кожи ракового происхождения с помощью фотосенсибилизации эозином и освещения ярким солнечным светом. Однако, при использовании акридина и эозина наблюдались побочные эффекты, что привело к прекращению дальнейших исследований. В 1911 г. была показана высокая фототоксичность гематопорфирина (Нр), а в 1924 г. было обнаружено избирательное накопление Нр опухолями [Polikard А., 1924]. Это открыло перспективы флуоресцентной визуализации опухолей [Auler, Banzer, 1942] и фототерапии рака [Figge et al., 1948].
В конце 50-х годов было показано, что неочищенные препараты гематопорфирина накапливаются в опухолях и их красную флуоресценцию можно видеть во время хирургической операции. При попытке очистить Нр была получена смесь различных производных, обогащенная олигомерными порфиринами, названная "производное гематопорфирина" (HpD). Оказалось, что HpD более селективно локализуется в опухолях, чем Нр. Авторы показали возможность использования HpD для флуоресцентной диагностики и разрушения опухолей [Schwartz et al., 1955; Lipson et al., 1960]. Широкое изучение ФД эффекта и применение фотодинамической терапии для лечения рака и ряда других заболеваний началось в середине 70-х годов с работ Dougherty и соавторов [Dougherty et al., 1975; 1976; 1978]. Одновременно с этим были начаты исследования по поиску наиболее эффективных красителей, которые продолжаются и в настоящее время.
Молекулы ФС подвергаются фотохимическим превращениям не в основном, а в электронновозбужденном состоянии. Поэтому началом фотодинамических реакций является поглощение света ФС. Поглощая свет, ФС из синглетного невозбужденного состояния переходит в короткоживущее синглетное электронно-возбужденное состояние (время жизни 10" -10" с), из которого осуществляется интеркомбинационная конверсия в триплетное состояние с большим временем жизни (10 4-10 с) [Владимиров и Потапенко, 2006]. ФС в триплетном возбужденном состоянии могут вступать в два типа реакций, приводящих к повреждению клеточных структур [Foote, 1991; Krasnovsky and Foote, 1993].
Согласно классификации Фута к типу 1 относят реакции, в которых ФС в триплетном возбужденном состоянии первоначально взаимодействует непосредственно с субстратом (С) либо растворителем: фс JlX_ 1 фс Зфс +С Фс" + С+ где ФС, ФС и ФС - молекулы фотосенсибилизатора в основном, синглетном и триплетном возбужденных состояниях, соответственно.
В данных реакциях между молекулой ФС в триплетном возбужденном состоянии и субстратом в основном состоянии происходит перенос электрона (или водорода): о2 О Фс"+с - Фс + о; Фс++ с"—2- о + с ? При этом в зависимости от реагирующей пары такой перенос может происходить как с субстрата на сенсибилизатор, так и с ФС на субстрат. В результате этого образуются свободные радикалы, и кислород подключается к этим реакциям на более поздних стадиях, приводящих к фотоокислению ФС и/или субстрата.
Некоторые классы ФС, например, флавины, кетоны, участвуют в ФД реакциях I типа [Girotti, 1990]. Так, флавины являются эффективными фотогенераторами супероксид-аниона [Schmidt and Butler, 1976; Schmidt, 1984]. Субстратами ФД реакций I типа часто являются легко окисляемые (фенолы, амины и т.п.) или легко восстанавливаемые (хиноны) молекулы [Ochsner, 1997].
В фотодинамических реакциях типа II фотовозбужденный краситель сначала взаимодействует с молекулярным кислородом, переводя его в высокоактивное синглетное состояние 02 - синглетный кислород: hv і з + і Фс » Фс Фс Фс + О Затем синглетный кислород взаимодействует с субстратом, окисляя последний (Сох):
В отличие от других молекул, основное состояние обычного молекулярного кислорода - триплетное с локализацией неспаренных электронов на разных орбиталях. В электронно-возбужденном синглетном состоянии спаренные электроны находятся на одной орбитали. Вторая орбиталь свободна, что и обусловливает высокую реакционную способность Ог [Владимиров и Потапенко, 2006].
Для понимания реакционной способности и функции синглетного кислорода в содержащих ФС биологических системах существенное значение имеет информация о времени жизни (гд) и длине пробега (/д) 02.
Из данных таблицы следует, что если генерировать синглетный кислород в водной среде или липидной мембране, он способен диффундировать на значительные расстояния от места генерации. В живых клетках, содержащих множество тушителей, диффузионная длина пробега меньше или сопоставима с размером одной мембраны, и 02 преимущественно дезактивируется в непосредственной близости от места генерации [Kanofsky, 1991; Moan, Berg, 1991; Krasnovsky, 1998]. Отсюда следует очень важный вывод: синглетный кислород должен повреждать биоструктуры в непосредственной близости от молекул ФС и повреждающее действие ФДТ во многом определяется локализацией ФС в клетке.
Окислительная способность 02 на два порядка выше, чем обычного кислорода [Владимиров и Потапенко, 2006]. Он может повреждать все основные компоненты клеток. Биомембраны особенно чувствительны к ФД воздействию. 02 и другие активные формы кислорода инициируют в них цепные процессы перекисного окисления липидов.
Структура и фотофизические свойства порфиринов
Неабсолютная селективность внутриклеточного распределения ФС предполагает существование множества внугриклеточных мишеней для ФД воздействия. При этом трудно выделить какое-либо одно критическое событие, ведущее к смерти клетки. Поэтому считают, что общее повреждение клетки связано с фотосенсибилизацией разных мишеней [Jori, 1996; Morgan, Oseroff, 2001].
Основные мишени ФД повреждения клеток, как правило, но не всегда определяются внутриклеточной локализацией ФС. В механизме повреждения клеток важную роль играет не только степень повреждения определенных клеточных структур, но и роль которую они играют в жизнеспособности клетки. Например, при кратковременной инкубации производное хлорина е6 накапливается в эндосомах, а наиболее сильные повреждения отмечаются в митохондриях [Kessel, Poretz, 2000].
Мембраны клеток (плазматические, митохондриальные, лизосомальные, ядерные, мембраны комплекса Гольджи и эндоплазматического ретикулума) являются потенциальными мишенями при проведении ФДТ [Dougherty et al., 1998]. Все ФС перед тем, как попасть в клетку, сорбируются на плазматической мембране (ПМ) и надолго или нет, задерживаются на ней. Гидрофильные ФС сильнее сенсибилизируют клеточную поверхность, в частности, связанные с мембраной белки и гликопротеиды, а липофильные - липидный бислой и гидрофобные участки интегральных или погруженных в мембрану белков. Основной механизм повреждения мембран - цепные процессы перекисного окисления липидов под влиянием фотоиндуцированных активных форм кислорода, а также фотоокисление аминокислот, приводящее к инактивации встроенных в мембраны белков[Оігопл, 1990, 2001]. Мембранные белки, в частности белки ионных каналов и транспортные АТФазы, оказались чувствительней липидов к фотоокислению гидробобными ФС [Specht and Rogers, 1991]. Окисление мембранных липидов и белков вызывает появление мембранных пор, изменение текучести мембран и подвижности ионов внутри мембраны.
В результате этих процессов повышается общая ионная проводимость мембраны [Specht and Rogers, 1991; Valenzeno, Tarr, 1991], ингибируются Na+,K+-, Mg2+- и Са2+-АТФазы [Dougherty et al., 1998]. Снижение максимальной проводимости мембраны для ионов Na+ и К+ свидетельствует о повреждении натриевых и калиевых каналов. Это вызывает деполяризацию клеточной мембраны и изменение биоэлектрических процессов [Specht and Rogers, 1991; Valenzeno, Tarr, 1991].
Kessel [1986] показал, что при кратковременной инкубации HpD сильнее фотосенсибилизирует ПМ, а при продолжительном - митохондрии. В первом случае это было связано с преимущественным накоплением мономеров, а во втором - димеров и олигомеров. ФД повреждение ПМ ведет к некрозу клеток, тогда как воздействие на митохондрии - к апоптозу [Dellinger, 1997; Kessel et al., 1997]. При этом один и тот же ФС в зависимости от концентрации и времени инкубации может вызывать некроз или апоптоз. Так, после 1-часовой инкубации Фотофрин накапливается в плазматической мембране и при облучении в клеіках развивается преимущественно некроз, а после 24-часовой инкубации, когда краситель распределяется по всей клетке, доминирует апоптоз [Dellinger, 1997].
Гидрофильные ФС, проникая через клеточную мембрану преимущественно пиноцитозом и/или эндоцитозом, локализуются в лизосомах и эндосомах. Облучение приводит к повреждению этих структур и высвобождению в цитоплазматическое пространство ФС, которые быстро перераспределяются в клетке [Berg, Moan, 1997]. При этом они неспецифически окрашивают цитоплазму, могут проникать в ядро [Berg, Moan, 1994, 1997; Zane et al., 2001]. Кроме того, в цитоплазматическое пространство высвобождаются лизосомальные гидролазы, что может явиться причиной гибели клеток [Berg, 1996].
ФД повреждению подвергаются практически все клеточные компоненты [Dougherty et al., 1998]. Однако, фотоповреждению митохондрий отдают все же главную роль в ФД-индуцированной смерти клетки. Фотоповреждение митохондрий может привести к следующим процессам, так или иначе участвующим в смерти клетки: падение производства АТФ, высвобождение депонированных ионов Са2+, высвобождение цитохрома с и запуск апоптоза [Berg, 1996; Kessel, Luo, 1999].
Наиболее эффективными считаются ФС, локализующиеся в митохондриях. Предполагается, что воздействие на митохондрии оптимально для ФДТ, т.к оно эффективно индуцирует апоптоз -предпочтительный с медицинской точки зрения тип смерти клеток [Kessel, Luo, 1999; Oleinik, Evans, 1998; Morgan, Oseroff, 2001; Oleinik et al., 2002].
Порфирины липофильны и обладают большим сродством к митохондриальным мембранам [Woodburn et al., 1992]. Митохондрии являются одной из главных мишеней цитотоксического действия производных гемотопорфирина и Фотофрина [Ricchelli et al.,1997].
Эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольджи играют центральную роль в биосинтезе и транспорте холестерола, фосфолипидов, простагландинов, а также мембран и белков. Фотохимическое повреждение этих систем, являющихся потенциальной мишенью при ФДТ, может привести к гибели клеток [Berg, 1996].
Большинство ФС не попадают в клеточное ядро. Липофильные ФС сенсибилизируют повреждение только небольшой части ДНК, находящейся вблизи ядерной мембраны [Berg, 1996; Kvam et al., 1992]. Поэтому, несмотря на высокую способность повреждать ДНК в растворах [Evensen and Moan, 1982], ФД воздействие не вызывает серьезных повреждений ДНК в живых клетках, мутаций и не является карциогеном [Moan, 1986; Dougherty et al., 1998].
Определение прочности связывания производных ДП с эритроцитами человека
Одним из факторов, влияющих на гемолитическую эффективность ФС, является прочность связывания ФС с мембраной эритроцита. Поэтому далее мы оценили связывание с эритроцитами производных ДП. Для этого были выбраны два соединения, входящие в одну группу сравнения - ДП2 и ДП5(рис. 1, табл. 2).
При добавлении ФС к суспензии эритроцитов, часть его связывается с мембраной и внутренними компонентами клеток, а другая часть остается растворенной в окружающей суспензионной среде. Считается, что при фотогемолизе за повреждение мембран отвечает только ФС, связавшийся с мембраной, тогда как не связавшийся не активен [Pooler, 1985]. Возможно, что часть связавшегося ФС останется в мембране, даже если удалить свободный ФС из суспензии, т.е. необязательно восстановится соотношение концентраций свободного и связанного ФС, равновесно установившееся до удаления свободного ФС из суспензии эритроцитов. Другими словами, часть молекул ФС, связывается с мембраной настолько прочно, что не переходит в окружающую среду, даже если из нее полностью удалить свободный ФС.
Для оценки способности ФС связываться с липидной фазой мембран принято определять коэффициент распределения октанол/буфер, который представляет собой равновесную константу распределения ФС между липидами мембран и окружающим водным раствором. Предполагается, что если уменьшить концентрацию ФС в буфере, то установится новое равновесие. Однако, в случае биологических мембран связывание ФС с мембраной необязательно бывает обратимым.
Известно, что ФС, связавшиеся с биологическими мембранами, не удается полностью отмыть путем замены суспензионной среды [Melnikova et al., 1999]. Какая-то часть остается прочно связанной с мембранами. При удалении ФС из суспензии эритроцитов часть молекул красителя, первоначально связавшихся с мембраной, может перейти в суспензионную среду. Гемолитический эффект в этом случае, в зависимости от прочности связывания ФС с мембраной, окажется либо сниженным, либо сравнимым с не отмытым контрольным образцом.
Для определения доли прочно связавшегося ФС необходимо отмыть клетки в свежей суспензионной среде и сравнить фотосенсибилизирующие эффекты в отмытой и не отмытой пробах. Если связывание ФС с мембраной не прочное, а равновесие обратимое, то после отмывания суспензии от ФС, гемолитический эффект должен практически исчезнуть. Если же связывание ФС с мембраной прочное, то после отмывания суспензии от ФС, эффект должен сохраниться или снизиться незначительно.
Ситуация методически осложняется тем, что одновременно с удалением непрочно связанного красителя удаляется неактивный, свободный ФС, обуславливающий оптический экранирующий эффект. Таким образом, отмывкой вызываются два противоположно направленных эффекта, уменьшение (за счет удаления части связанного активного ФС) и увеличение (за счет уменьшения экранировки) скорости фотогемолиза. Экранирующий эффект можно уменьшить экспериментально путем уменьшения толщины облучаемого раствора. Помимо эгого экранирующий эффект можно учесть расчетным путем. Оба эти подхода были использованы в нашей работе при определении доли ФС, прочно связанною с мембранами эритроцитов.
Определение прочности связывания красителей с мембранами эритроцитов проводили по схеме ( хемл 2 Определение прочности свяімвания ФС с мембранами ритрпціпоп суспензия эритроцитов t ФС инкубация в темноте 30 мин при 37 С иентрифугироіание / ч ресуспензирование в той же среде отбирали супернатант и заменяй равным ему но объему ФЬР + УФА ,,-r УФА инкубация в темноте при 37 С инкубация в темноте при 37 С t 1 регистрация гемолиіа реіистрацня гемолиіа Суспензию эритроцитов с добавленным ФС инкубировали в темноте, затем разделяли на равные объемы и центрифугировали После этого один образец ресуспензировали в той же надосадочной жидкости, а в другом заменяли супернатант на не содержащий красителя ФБР. Затем образцы облучали при одинаковых условиях и далее регистрировали гемолиз скорость гемолиза, исправленная с учетом эффекта экранировки. Доза облучения при 365 нм 6,24 кДж/м2. Концентрация фотосенсибилизатора в суспензии эритроцитов 10"5 М. Концентрация эритроцитов в суспензии 107кл/мл. Температура суспензии клеток при инкубации 37 С. а - толщина слоя 1 см; б - толщина слоя 0,1 см.
После отмывки суспензии от красителя (столбец 2) скорость гемолиза при облучении в слое толщиной 1 см возросла примерно на 80 % по сравнению со скоростью в не отмытом образце (заштрихованный столбец 1). Следовательно в этом случае наблюдался сильный экранирующий эффект и после удаления свободного ФС скорость гемолиза возрастала. При этом ФС, связавшийся с мембранами, не удалялся отмыванием и обуславливал фотогемолитический эффект в отмытом образце. Это подтверждает предположение о том, что эффективным является краситель, связанный с мембраной, тогда как свободный краситель не эффективен и бесполезно поглощает свет.
Для экспериментального уменьшения экранирующего эффекта уменьшили оптическую длину пути света, заменив кюветы для облучения образцов на более тонкие (толщина облучаемой суспензии 0,1 см, рис. 9, б). После отмывания суспензии эритроцитов от красителя (столбец 2) скорость гемолиза снизилась на 30 % по сравнению со скоростью в не отмытом образце (заштрихованный столбец 1). Следовательно, в этом случае экранирующий эффект был выражен значительно слабее, чем в толстом слое (рис. 9, а). В то же время часть ФС осталась прочно связанной с мембранами, тогда как другая часть была отмыта, что и обусловило снижение скорости гемолиза.
Экранирующий эффект свободного ФС можно учесть расчетным путем, введя соответствующие поправки (незаштрихованные столбцы 1 на рис. 9, а и б), как это описано ниже.
Как показано в 1.6. скорость фотогемолиза описывается уравнением (1). Для удобства использования это уравнение можно упростить. В наших опытах скорость темнового гемолиза V0 была много меньше скорости фотогемолиза V, поэтому величиной V0 можно пренебречь и уравнение (1) примет вид: V aD\ (4) Нужно учитывать, что эффективной является не вся доза света, падающего на образец, а только поглощенная Dn0lJl связавшимся с мембраной ФС. Между падающей и поглощенной дозами существует линейная зависимость. Таким образом, уравнение можно записать в виде:
V«aDl,. (5) Дозу, поглощенную связавшимся с мембраной ФС, можно рассчитать следующим образом: hoJ = Dmi, (6) где Іпог.і интенсивность света, поглощаемая активным ФС (связанным с мембраной), t - время облучения.
По аналогии с расчетом экранирующего эффекта, используемом во флуоресцентном анализе [Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я., 2006], можно написать выражение для интенсивности света, поглощенного связанным красителем в присутствии экранирующей примеси 1погл 1:
Угнетение функций эффекторов КЧ и активация клеток с супрессорным потенциалом
На 21 видно, степень супрессии КЧ зависит от момента введения ФПП1 относительно сенсибилизации. ФПП1 вызывал практически полную супрессию реакции КЧ (87 ± 15 %) при его введении за 20 ч до сенсибилизации животных ДНФБ (афферентная фаза КЧ, охватывает момент узнавания и процессинга гаптена ДНФБ АГ-презентирующими клетками кожи, миграцию АГ-презентирующих клеток к лимфатическим узлам) Если ФПП1 вводили через 27 часов (момент презентации в лимфоузлах ДНФБ Т-лимфоцитам АГ-презентирующими клетками) или 80 часов (максимум пролиферативной активности ДНФБ-специфических лимфоцитов in vivo), то супрессия КЧ составляла 53 ± 7 и 57 ± 20 %, соответственно. Супрессорное действие ФПП1 было наименьшим (26 ± 4 %) в случае введения данного соединения на эффекторной фазе КЧ (за 24 часа до повторной аппликации животным ДНФБ).
Полученные результаты могут быть объяснены двумя способами. Во-первых, к супрессорному действию ФПП1 наиболее чувствительными могут быть начальные фазы развития КЧ. Во-вторых, характер фармакокинетики и медленное перераспределение ФПП1 в тканях могут приводить к достижению молекулами ФПП1 клеток-мишеней только лишь через несколько дней после внутривенного введения данного соединения животным. На возможность последнего указывают данные, что концентрация в тканях большинства порфиринов возрастает в течение 10-72 часов после их применения [Bossu et al., 2000; Moan et al., 2003].
Результаты, представленные на рис. 21, не позволяют сделать вывод о механизме ограничения развития КЧ при действии ФПП1. Тем не менее, с учетом представленной в литературе информации о патофизиологических и иммунологических механизмах, обеспечивающих протекание реакции КЧ [Gorbachev and Fairchild, 2001а; Grabbe and Schwarz, 1998], можно предположить, что действие ФПП1 могло быть направлено на модуляцию (угнетение или активацию) функций иммунокомпетентных клеток, опосредующих или регулирующих развитие реакции КЧ.
Известно, что развитие КЧ на ДНФБ опосредуют эффекторные АГ-специфические CD8+ Т-лимфоциты [Grabbe and Schwarz, 1998; Kobayashi et al., 2001]. В этой связи нами была изучена возможность реализации супрессорного действия ФПП1 через угнетение функций АГ-специфических эффекторов КЧ.
Также хорошо известно, что реакция КЧ может быть перенесена от сенсибилизированного животного интактному (несенсибилизированному) АГ-специфическими Т-клетками, а не сывороткой [Black, 1999; Grabbe and Schwarz, 1998]. Поэтому, общепринятым подходом для выявления действия различных агентов, включая ФДТ, являются опыты по адоптивному переносу эффекторов КЧ [Musser and Oseroff, 2001; Simkin et al., 1997]. Данный подход был использован нами для выявления действия ФПП1 на эффекторные Т-лимфоциты КЧ.
Мы изучили влияние in vivo ФПП1 на количество клеток в селезенках ДНФБ-сенсибилизированных мышей и на сохранение способности клеток-эффекторов КЧ адоптивно переносить данную реакцию (схема 4).
Для этого 0,5 мл раствора ФПП1 (0,1 мкМ в ФБР, содержащем 0,4 % этанола и 0,6 % ПЭГ) вводили внутривенно мышам-донорам линии СВА за 21 час до сенсибилизации ДНФБ. Мышей-доноров сенсибилизировали путем накожной аппликации 0,3 % раствора ДНФБ в ацетоне. Через 142 часа после сенсибилизации ДНФБ выделяли спленоциты мышей-доноров, которые, затем, отмывали дважды путем центрифугирования (10 мин, 400 g), подсчитывали абсолютное количество белых клеток (спленоцитов), и затем для опытов с адоптивным переносом КЧ доводили концентрацию суспензии клеток до 108 кл/мл. Сингенным интактным мышам-реципиентам вводили внутривенно 108 спленоцитов мышей-доноров. Через 2 часа после переноса спленоцитов мышей-реципиентов тестировали путем накожной аппликации на внутреннюю поверхность уха 0,2 % раствора ДНФБ в ацетоне.