Сопряжение между фотосистемой 1 и цитохромным b6f комплексом в модельных системах Витухновская, Лия Алексеевна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Исследование фотосинтеза, как комплекса реакций превращения солнечной энергии в энергию химических связей, представляет собой одну из наиболее актуальных проблем современной биологии.

В фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) высших растений, водорослей и цианобактерий функциональными блоками являются фотосистемы (ФС) 1 и 2, а также цитохромный (цит) b(f комплекс, осуществляющий перенос электронов от липофильного двухэлектронного донора пластохинола на одноэлектронный водорастворимый белок пластоцианин (ПЦ) или цит с₆ (альтернативный переносчик электронов у цианобактерий). Согласно классической линейной Z-схеме фотосинтетическая ЭТЦ обеспечивает расщепление воды с образованием кислорода на донорной стороне ФС 2 и восстановление НАДФ до НАДФН на акцепторной стороне ФС1.

В некоторых условиях (присутствие ингибиторов ФС 2, анаэробиоз) наблюдается циклический транспорт электронов, включающий только два пигмент-белковых комплекса фотосинтетической цепи - ФС 1 и цит b(f комплекс. Однако механизм этого процесса недостаточно изучен, поэтому исследование взаимодействия между ФС 1 и цит b$f комплексом представляется важной и актуальной проблемой.

ФС 1 осуществляет фотоиндуцированное трансмембранное разделение зарядов, сопряженное с транспортом электронов от периферических белков - цит с,; или ПЦ к природным акцепторам - ферредоксину (или альтернативному акцептору электронов у цианобактерий - флаводоксину) от первичного донора электронов - димера хлорофилла Р700 через цепь кофакторов - Ао (хлорофилл а), Ai (филлохинон или витамин Ki) и железосерные кластеры F_x, F_A, F_B.

Цит b(f комплекс, согласно схеме Q-цикла, предложенной Митчелом (Mitchell, 1975), окисляет молекулу пластохинола (PQH₂) в хинол-оксидазном Q₀-сайте. Окисление PQH2 сопровождается депротонированием, при этом один электрон поступает на высокопотенциальный участок цепи (железо-серный центр Риске - цитД а другой - на цит Ь, восстанавливая связанную с хинон-редуктазным сайтом Q, молекулу пластохинона (PQ) с образованием семихинона. При повторном обороте фермента семихинон анион-радикал восстанавливается до PQH2. Таким образом, в результате полного цикла работы b(f комплекса происходит окисление двух молекул PQH₂, за которым следует выброс 4 Н⁴" в люмен, поглощение 2 Н⁺ из стромы и восстановление одной молекулы PQ в Q, сайте.

Значительный прогресс в изучении этих двух белковых комплексов был связан

с проведением рентгеноструктурного і нЙ&аНАЙЙ$йМ>Ь^гФ 1 из термофильной цианобактерий Synechococcus elongatue с разрвшщеди.5 A (Jordan et al, 2001), и

цит b$f комплекса из термофильной цианобактерии Mastigocladus laminosus с разрешением 3,5 A (Kurisu et al., 2003) и из водоросли Chlamydomonas reinhardtii с разрешением 3,1 A (Stroebel et al., 2003). Были оценены расстояния между кофакторами ферментов, а также выявлены основные структурные особенности Ь$ комплекса, в частности, был найден новый, ковалентно-связанный гем х, по-видимому, относящийся к гемам типа с'. Предполагается, что гем х может участвовать в циклическом перенос электронов.

Транспорт электронов между 6,/комплексом и ФС 1 ранее изучали, главным образом, на нативных объектах: листьях высших растений, хлоропластах, субхлоропластных частицах и клетках цианобактерии. Перенос электронов между выделенными из высших растений белками ФС 1 и btf исследовали только в растворе (Rich et al, 1987). В нашей работе впервые была предпринята попытка изучить взаимодействие между этими двумя пигмент-белковыми комплексами в мембранах протеолипосом с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии, ЭПР спектроскопии и прямого электрометрического метода.

Перенос электронов при функционировании b$f комплекса сопряжен с генерацией трансмембранной разности электрических потенциалов (Ду), образование которой до настоящего момента изучалось методом регистрации электрохромного сдвига полос поглощения каротиноидов в тилакоидах хлоропластов (Jones & Whitmarsh, 1988) и целых клетках (Joliot & Joliot, 1994, 1998). Этот метод, несмотря на широкое применение, является косвенным, и при интерпретации данных не вполне однозначным. Было предположено, что основная электрогенная стадия (70-75%) обусловлена переносом электрона между двумя гемами b, в то время как оставшиеся 25-30% электрогенеза, вероятно, связаны с окислением цитохрома Ъ wJwm с поглощением протонов из стромы при восстановлении PQ в сайте Q,. Тем не менее, анализ литературных данных показывает, что как механизмы сопряжения электронного транспорта с образованием Д\|/ в цит b(f комплексе, так и природа наблюдаемых электрогенных стадий остаются невыясненными.

Более прямым способом регистрации образования мембранного потенциала в ответ на лазерную вспышку является электрометрический метод, разработанный в НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ. Ранее этот метод был успешно применен для изучения природы и механизмов электрогенных реакций в функциональном аналоге btf комплекса - цитохромном bc_t комплексе пурпурных фотосинтезирующих бактерий. Однако электрометрический метод не применим к целым клеткам и хлоропластам. Для регистрации мембранного потенциала этим методом необходимо было выделить комплексы b,f и ФС 1, встроить их в мембраны протеолипосом и подобрать условия эффективного взаимодействия. В настоящей работе электрогенные реакции, сопровождающие перенос зарядов в

цит b комплексе были впервые исследованы в модельной системе. Применение прямого электрометрического метода позволяет с большей достоверностью определить природу электрогенных реакций в b(f комплексе и относительный вклад отдельных реакций переноса зарядов в суммарный электрогенез.

Целью настоящей работы явилось изучение образования Д^, генерируемого цит Ъ4 комплексом, с помощью прямого электрометрического метода, разработанного в НИИ ФХБ им А.Н. Белозерского МГУ, в модельной системе, состоящей из выделенных белков ФС 1 и brf комплекса. Для этого были проведены предварительные эксперименты с использованием методов импульсной абсорбционной спектрометрии и ЭПР спектроскопии.

Были поставлены следующие задачи:

1) Сконструировать функционально-активную гибридную систему,
состоящую из ФС 1 и цитохромного 6,/комплекса, а также продемонстрировать ее
функционирование с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии.

1. Подобрать условия встраивания ФС 1 и цитохромного b(f комплекса в мембраны протеолипосом и определить их ориентацию в мембранах.

2. Исследовать индуцированные светозависимым окислением Р700 в ФС 1 редокс реакции цитохромов Ъ и/ в растворе и в гибридных протеолипомах

3. Продемонстрировать взаимодействие между ФС 1 и цитохромным b/f комплексом в протеолиносомах путем реї истрации светозависимых сигналов ЭПР от катион-радикала Р700⁺.

4. С помощью прямого электрометрического метода изучить индуцированное лазерными вспышками образование трансмембранной разности электрических потенциалов, генерируемое цит ^/"комплексом в гибридных протеолипосомах.

Научная новизна работы. Впервые была сконструирована функционально-активная модельная система, включающая выделенные пигмент-белковые комплексы цит Ь(/и ФС 1 в мембранах протеолипосом. На основании результатов, полученных с помощью импульсной абсорбционной спектрометрии, продемонстрировано эффективное взаимодействие двух белков в этой системе. Окислительно-восстановительные реакции цит b и / инициировались светоиндуцированным окислением Р700.

Были подобраны условия встраивания, при которых цит / b_ff комплекса и Р700 ФС 1 оказались локализованными вблизи от внешней поверхности протеолипосомальной мембраны. Это условие бы то необходимо для сопряженного электронного транспорта, опосредованного экзогенным цит с₆.

Светозависимый перенос электронов в гибридных протеолипосомах был исследован методом ЭПР спектроскопии в Х- диапазоне. Взаимодействие между белковыми комплексами регистрировали по фотоиндуцированным изменениям сигнала ЭПР (I) от катион-радикала Р700⁺. Сопряжение между цит b_ff комплексом

и ФС 1 наблюдалось только в присутствии цит с₆ и химически восстановленного децилпластохинона (DPQH₂), служащего донором электронов для цит Ь комплекса. Ингибитор Q₀ сайта стигмателлин уменьшал амплитуду сигнала ЭПР и замедлял темновой спад, что свидетельствовало о переносе электронов от Ъ$ комплекса к ФС 1.

С помощью прямого электрометрического метода впервые были исследованы электрогенные реакции в гибридных протеолипосомах, содержащих ФС 1 и цит btf. Продемонстрировано наличие, по крайней мере, двух электрогенньгх стадий, обусловленных работой hrf комплекса: 1) NQNO- чувствительной, связанной с протонированием PQ в сайте Q,; 2) стигмателлин-чувствительной, связанной с переносом электрона между низкопотенциальным гемом hi и высокопотенциальным гемом Ь/,, или с электрогенным выбросом протонов в сайте Q₀ при окислении PQH₂.

Практическое значение работы. Результаты исследования существенно углубляют современные знания о природе и механизмах хчектрогенных реакций в цит Ъ$ комплексе, а также о возможных взаимодействиях между мембранными белками. Использование модельной системы позволяет более точно выявить относительный вклад отдельных реакций переноса зарядов в суммарный электрогенез в Ъ/f комплексе. Определение оптимальных условий встраивания и взаимной ориентации ФС 1 и b комплекса в мембранах протеолипосом может быть использовано для изучения взаимодействия между другими мембранными белками в модельных системах. Кроме того, фотосинтешческие модельные системы могут быть использованы для изучения механизмов циклического переноса электронов, регуляции фотосинтетического переноса зарядов, а также для мониторинга окружающей среды, в частности для детектирования загрязнений гербицидами и ионами тяжелых металлов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XVII Пушинских чтениях по фотосинтезу «Первичные процессы фотосинтеза в бактериальной и растительной фотосистеме II» (Пущино, 2002), на Международной конференции «Молекулярная биознері етика цианобактерий» (Италия, Аквафредца ди Маратеа, 2003), на XVIII Путинских чтениях по фотосинтезу «Первичные процессы фотосинтеза» (П>щино, 2003), на 13^ой Европейской биоэнергетической конференции (Италия, Пиза, 2004), на Московском городском семинаре по биоэнергетике (2004), на З^ей Всероссийской школе-симпозиуме «Динамика и структура в химии и биологии» (Черноголовка, 2005) и на семинаре кафедры биофизики МГУ (2005).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 8 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения,

выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована схемами, таблицами и рисунками.