Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Для решения фундаментальных и прикладных задач современной биофизической химии, молекулярной биологии я генной инженерии необходимо иметь структурно-функциональную информацию об изучаемых биообъектах. Традиционные высокоинфорыативные методы инфракрасной спектроскопии (ИК), спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) и кругового дихроизма (КД) далеко не всегда обладают необходимой для исследования сложных биологических систем чувствительносты) и селективностью.
Появившаяся в начале 00-х годов новая разновидность метода КР - спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния света (ГКР) позволила существенно расширить возможности исследования биомолекул с помощью физических методов анализа. Метод ГКР позволяет резко снизить количество исследуемого вещества, а также в ряде случаев проводить селективный анализ отдельных компонентов в надмолекулярных комплексах. Однако, несмотря на значительные успехи в применении спектроскопии ГКР к исследованию структуры водорастворимых и мембранных белков, фермент-субстратных взаимодействий, физико-химических свойств молекул на заряженной границе раздела и т.д., потенциальные возможности метода остаются до конца не реализованными. В основном это связано с отсутсвием универсальных воспроизводимыми и стабильными во времени экспериментальных систем, позволяющих получать спектры ГКР от широкого класса биообъектов в нативном состоянии. Кроме того, для решения задач, связанных с исследованием единичных живых клеток, локальных изменений конформации ДНК, анализа сложных биомедицинских экстрактов и т.д., необходимо увеличение чувствительности и селективности существующих методгк получения спектров ГКР.
Поэтому в настоящее время весьма актуальной становится разработка новых экспериментальных систем, позволяющих реализовать большие потенциальные возможности спектроскопии ГКР, что может значительно увеличить объем и качество информации о структурно-функциональных связях в изучаемых биологических системах In vitro и in vivo, а также позволит проводить анализ с использованием пикограммовых количеств вещества.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Основной целью настоящего исследования является разработка новых методических подходов, позволяющих увеличить селективность и чувствительность спектроскопии ГКР. и их
- г ~
применение к детектированию участков дестабилизации двойной спирали ДНК, идентификации входящих в их состав нуклеотидвых оснований, анализу структуры комплексов противоопухолевых препаратов с ДНК In vitro и In vivo, изучению распределения противоопухолевых лекарств в единичной живой раковой клетке, а также анализу биомедицинских экстрактов из хрусталиков глаз человека и животных.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. 6 настоящей работе впервые
1. Разработана новая экспериментальная система для получения
спектров ГКР биомолекул - "активированный" гидрозоль металла -
обеспечивающая селективность анализа сложных биомолекул и
надмолекулярных комплексов.
2. По данным спектров ГКР предложены структурные модели
комплексов противоопухолевых препаратов 4'0-тетрагидропиранил-
доксорубицина и аклациномицина с их мишенью (ДНК).
3. Получены спектры ГКР от ядра и цитоплазмы единичной живой
клетки. Обнаружено наличие промежуточной мишени для
противораковых лекарств в цитоплазме клетки.
4. Изучены спектры ГКР микропроб взятых из хрусталиков
здорового человеческого глаза и глаза человека больного
катарактой. Установлено, что при развитии катаракты в хрусталике
происходит накопление производных тирозина и триптофана при
уменьшении относительной концентрации производной аденина.
5. Разработана новая экспериментальная система TKF-активные
поверхности на основе ядерных фильтров. Продемонстрирована их
"Заменимость в аналитических приложениях и фундаментальных
структурно-функциональных исследованиях.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Разработанная методика получения спектров ГКР на преагрегированных гидрозолях серебра и обнаруженный эффект "активации" гидрозоля анионами С1~ применимы для исследования вторичной структуры уникальных природных нуклеотидных последовательностей, а также изучения связи между первичной нуклеотидной последовательностью и вторичной структурой ДНК.
Полученные данные о структуре комплексов противоопухолевых препаратов с ДНК важны при сравнительном анализе биологической активности различных лекарств.
Метод получения спектров ГКР от ядра и цитоплазмы единичной живой клетки может быть успешно применен для исследования
клеточного метаболизма, структуры сложных биомолекул и надмолекулярных комплексов In vivo Перспективны приложения микроспектроскопия ГКР в медицине при определении резистентности раковых клеток из тканей индивидуальных пациентов к различным противоопухолевым лекарствам.
Обнаруженный эффект накопления производных тирозина и триптофана при развитии катаракты у человека может быть использован при разработке новых систем экспресс-диагностики заболевания, а также при изучении механизмов его возникновения.
Новая технология получения ГКР-активных поверхностей может найти широкое применение при изготовлении высокочувствительных детекторов в приборах новых поколений.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ,ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. Автор защищает
1. Метод получения спектров ГКР от суопикограммовых
количеств нуклеиновых кислот.
2. Эффект "активации" гидрозоля анионами 01 ~. Возможность
его применения для селективной регистрации веществ в сложных
смесях или отдельных компонентов в надмолекулярных комплексах и
сложных биомолекулах.
3. Структурные модели комплексов противоопухолевых
препаратов 4'0-тетрагидропиранил-доксорубицина и аклациномицина с
ДНК.
4. Метод получения спектров ГКР от ядра и цитоплазмы
единичной живой раковой клетки. Возможность изучения этим методом
распределения противоопухолевых лекарств в ее составе.
5. Технологию получения новых ГКР-активных поверхностей на
основе ядерных фильтров и их применимость в аналитических
приложениях и фундаментальных структурно-функциональных
исследованиях.
АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ- РАБОТЫ. Основные результаты работы докладывались на II Всесоюзном семинаре "Лазерная биофизика и новые применения лазеров в медицине" (Тарту, 1989), 17 Всесоюзной конференции по спектроскопии комбинационного рассеяния света (Ужгород, 1989), III и 17 Европейских конференциях по спектроскопии биологических молекул (Римини, 1989; Йорк, 1991), XII Международной конференции по Раман спектроскопии (Колумбия, 1990), III Международной конференции по спектроскопии лазерного рассеяния и диагностики биологических объектов (Москва, 1990), V Еврофизической летней школе по структуре и конформационной
динамике биомакромолекул (Высокие Татры, 1990), VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991).
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 14 работ.
ОВЬЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация содержит 143 стр. машинописного текста, включая список литературы (88 наименований) I таблицу и 41 рисунок. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения и списка литературы.