Стохастическая модель мотора F1-АТФазы Погребная Александра Францевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Общие сведения о ферменте 14

1.1. Энергетические ресурсы клетки 14

1.2. Общая характеристика FiFo-АТРсинтазы 18

1.3. Пространственное строение АТРсиптазы 20

1.4. Каталитические центры Fi-АТФазы 21

1.5. Каталитический цикл. Двух- и трех- центровий механизм катализа 23

1.6. Структурные перестройки Fi-АТРазы (вращение ротора) 26

1 7. Теоретические модели мотора Fi-АТФазы 33

Выводы 38

Глава 2. Электростатические взаимодействия в каталитических центрах F,-ATPa3bi 39

2.1. Вычисление энергии фермент-субстратного комплекса 39

2.2. Конформационпые состояния фермент-субстратного комплекса. 41

2.3. Результаты расчетов и их обсуждение 43

2.4. Обсуждение результатов 56

Выводы 58

Глава 3. Стохастическая модель молекулярного мотора Р АТФазы 59

3.1. Потенциалы взаимодействия ротора и статора молекулярного мотора 60

3.2. Основные уравнения 67

3.3. Численное решение уравнений 71

3.4. Результаты численного моделирования работы мотора по вращению нагрузки 74

Выводы 84

Глава 4. Синтез АТФ Fj-АТАФазой в стохастической модели 85

4.1. Последовательность событий в режиме синтеза АТФ 85

4.2. Основные уравнения 87

4.3. Результаты численного моделирования синтеза АТФ под действием постоянного внешнего вращающего момента 89

Выводы 98

Заключение 100

Литература 103

• Каталитический цикл. Двух- и трех- центровий механизм катализа
• Теоретические модели мотора Fi-АТФазы
• Конформационпые состояния фермент-субстратного комплекса.
• Результаты численного моделирования работы мотора по вращению нагрузки

Введение к работе

Актуальность темы диссертации

Молекулярные моторы - общепринятый термин для группы белков, совершающих движение благодаря превращению химической энергии гидролиза в механическую энергию. Если еще тридцать лет назад концепция и термин «белок-машина», введенные в работах ЛА. Блюменфельда, Ю.И.Хургина, Д.С.Чернавского и С.Э.Шноля, вызывали разнообразные возражения, то сейчас о молекулярных машинах можно прочитать не только в специальной литературе, но и в массовых периодических изданиях. В последние годы, не только были открыты многие белковые моторы, но и предпринимаются попытки их использования для манипуляций с отдельными молекулами в нанобиотехнологиях. Существуют два больших класса моторов: линейные и вращающиеся моторы. К линейным моторам относятся кинезин («шагающий с ноги на ногу» вдоль микротубулина), миозин (при взаимодействии с актином обеспечивает сокращение мышечных волокон), РНК полимераза и т.д. Примерами вращающих моторов являются: флагелярные моторы (в бактериальных клетках) и фермент АТФсинтаза (FjFj-АТФаза, вращающийся во время синтеза/гидролиза молекул АТФ). Все молекулярные моторы, так или иначе, используют энергию синтеза/гидролиза нуклеотидов (АТФ) либо разницу электрохимического потенциала на цитоплазматической мембране. В настоящее время усилиями сотен исследователей достоверно показано, что ферментативная молекула FjFj-АТФсинтаза - молекулярный мотор, использующий оба типа энергии. Он синтезирует АТФ (аденозинтрифосфорной кислоты) из ДЦФ (аденозиндифосфорной кислоты) и неорганического фосфата в комплексе F₁ (F₁ АТФаза) за счет протонов проходящих через комплекс F₀, встроенный в энергопреобразующую мембрану митохондрий, хлоропласгов и бактерий. И наоборот: работая в обратном направлении, он гидролизирует АТФ в ДЦФ и неорганический фосфат - Р_Р вырабатывая энергию и перекачивая протоны.

К настоящему времени доказано, что не только гидролиз АТФ может происходить в изолированном фрагменте -Fj-АТФазе, но и синтез АТФ. F_rАТФаза работает как мотор, внутри которого вращается у субъединица по центру статора -состоящего из трех идентичных копий ар субъединиц. Вращение инициируется

конформационными изменениями 3(а р) субъединиц Такой результат, доведенный до уровня «наглядности», получен в тонких биохимических и биофизических экспериментах с применением методов рентгеноструктурного анализа и оптики с использованием лазеров и видеотехники

Не менее важную роль в осмысливании работы такого мотора сыграло математическое моделирование К настоящему времени предложены уравнения динамики ротора (у- субъединицы) При этом силовые поля вводятся из общих феноменологических представлений С другой стороны прилагаются усилия для построения полной модели FjFj-АТФ-синтазы Более того, сделаны первые попытки для проведения такого моделирование методами молекулярной динамики в которых учитываются движения более чем 30000 атомов F₀ Fj-АТФ-синтазы и молекул АТФ. АДФ, Pj Даже использование современных компьютеров в этом случае позволяют проследить собьп ия лишь на протяжении сотен пс, чего совершенно недостаточно, так как характерные времена конформационных переходов составляют миллисекунды Кроме того, анализ результатов и точности их получения в такой глобальной модели является сам по себе чрезвычайно сложной задачей

Безусловно, такое моделирование будет резутьтативным и эффективным, если будет проводиться наряду с моделированием более простых систем с небольшим числом выделенных «существенных» степеней свободы Такие степени свободы всегда имеются как в технических устройствах так и в молекулярных машинах Именно поэтому такие конструкции и называются машинами Настоящая работа лежит в русле исследований, в которых строятся модели, отражающие изменения существенных переменных Влияние других атомов учитывается введением суммарных потенциалов взаимодействия и тепловых шумов

Цели и задачи диссертационной работы.

Основной целью работы является построение и анализ модели стохастической динамики Fj-АТФазы в режиме гидролиза и синтеза АТФ При постановке задачи предполагалось, что проведенные исследования позволят

Построить замкнутую систему кинетических уравнений, описывающих

химические процессы (посадки субстрата, выхода продуктов

реакции а также химическую реакцию гидролиза/синтеза) в активных центрах

реакцию іидролиза/синтеза в активных центрах фермента с

направленным вращением ротора (у субъединицы).

Получить количественные характеристики и закономерности поведения

мотора в зависимости от экспериментально устанавливаемых

параметров. Для решения поставленных задач необходимо было построить модельные потенциалы, описывающие взаимодействие между ротором и статором молекулярного мотора. Для определения функций, определяющих вращение ротора, была проведена серия вычислений, в которых оценивалась энергия электростатического взаимодействия гидролизированых атомов молекул субстратов и продуктов с заряженными и поляризованными аминокислотными остатками каталитических центров Fj-АТФазы во всех конформациях фермент-субстратного комплекса. Подробно исследованы режимы вращения мотора в зависимости от различных экспериментально определяемых параметров.

Научная новизна работы.

1. Оценена энергия электростатического взаимодействия в фермент-субстратном комплексе Fj-АТФазы на различных этапах каталитического цикла в известных устойчивых конформациях фермент-субстратного комплекса. Показано, что изменение электростатической энергии адекватно описывает процессы, происходящие в фермент-субстратном Fj-АТФазы комплексе во время каталитического цикла гидролиза АТФ.

2. На основании расчета электростатических взаимодействий в фермент-субстратном комплексе определены форма и количественные характеристики предложенных потенциалов взаимодействия между каталитическими субъединицами и ротором молекулярного мотора. Данные потенциалы позволяют описать направленное движение ротора в результате гидролиза АТФ и наоборот описать синтез АТФ в результате направленного движения ротора под действием момента внешней силы.

3. Разработана замкнутая модель мотора Fj-АТФазы, в которой учитываются как существенные динамические переменные, так и переменные, описывающие химическую кинетику. На основе исследования данной модели определены

статистические характеристики динамики мотора и кинетика химических превращений в широком временном диапазоне (до нескольких минут) (тогда как молекулярная динамика позволяет пока это делать лишь на временах порядка сотен пс)

Научная и практическая ценность работы определяется возможностью

Проследить стохастическую динамику работы АТФазы в «иммобилизованном»

режиме Осмыслить качественно и количественно работу отдельных элементов

совершенной конструкции молекулярного мотора - важнейшего

нанотехнологического объекта, возникшего в результате биологической

эволюции Модель может помочь в выборе стратегии и определении параметров

соответствующих биофизических экспериментов

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на семи международных конференциях Saratov Fall Meeting 2002 Optical Technologies in Biophysics and Medicine IV (Saratov, Russia, October 1-4, 2002), 10-я Международная конференция «Математика Компьютер Образование» (Пущино, 20-25 января 2003г), International Workshop «Stochastic dynamics of complex systems» (Berlin September 2003), Complex Dynamics, Fluctuations, Chaos and Fractals in Biomedical Photonics (San-Jose, California USA, 24-29 January, 2004), III СЪЕЗД БИОФИЗИКОВ РОССИИ (Воронеж, 24-29 июня 2004 г), 1" International Workshop on Noise in Condensed Matter and Complex Systems (Citta' del Mare - Terrasini (Palermo) -26-29 July 2004), 12-я Международная конференция «Математика Компьютер Образование» (Пущино, 17-22 января 2005г)

Публикации: по материалам диссертации опубликовано семь работ, из них одна в реферируемом журнале, две в сборниках трудов и четыре в тезисах конференций

Структура и объем диссертации

Каталитический цикл. Двух- и трех- центровий механизм катализа

Схема каталитического цикла гидролиза/синтеза для одного центра показана на рисунке 1.6. Она включает в себя вход субстрата в каталитический карман, его тесное связывание с аминокислотными остатками, формирующими каталитический центр. Затем происходит реакция синтеза/гидролиза. На следующем этапе выход продуктов гидролиза. Согласно [30,86,87] вначале происходит выход фосфата затем выход АДФ. Различные исследователи приводят сильно различающиеся данные по константам скорости kti [97-100].

Согласно ранним данным Бойера с сотрудниками [54,56], реакция гидролиза/синтеза АТР, протекающая в каталитическом центре Fi-АТРазы, является обратимой и имеет константу равновесия, близкую к единице. Это означает, что стандартная свободная энергия для реакции MgATP + Н2О - MgADP + Pj, протекающей в активном центре фермента, близка к нулю. Это положение, ставшее уже хрестоматийным, в последнее время оспаривается Вебером и Сеньером [26-31]. Согласно последним данным (см. обзоры [28, 30]), соотношение между MgATP и MgADP в «закрытом» каталитическом центре должно зависеть от направления процесса. В условиях синтеза АТР равновесие сдвинуто в сторону MgATP; в условиях гидролиза АТР - в сторону образования MgADP и Pi.

В настоящее время в литературе активно дискутируется вопрос о двух возможных механизмах работы Fj-АТРазы [26-31,54-56]. Речь идет о так называемых «двухцентровом» (bi-site) и «трехцентровом» (tri-site) механизмах. Согласно модели Бойера [54-56], при функционировании FrATPa3bi в каждый момент времени не более двух каталитических центров содержат нуклеотиды, при этом один из трех каталитических центров остается свободным. Двуцеитровый механизм хорошо согласуется со структурными данными, полученными группой Уокера в работах [32-43]. Однако этот механизм оспаривается в последних работах Вебера и Сеньера [26-31], которые убеждены в том, что в ходе работы фермента все три каталитических содержат нуклеотиды. Их уверенность основана на измерениях сродства каталитических центров БрАТРазы к различным нуклеотидам (Табл. 1.1). Согласно [26-31], при физиологических концентрациях АТР в клетке ( 1 мМ) все три каталитических центра с очень высокой вероятностью должны содержать нуклеотиды. На данный момент принимается, что при низких концентрациях АТФ (до десятков нМ) АТФаза работает в режиме двуцентрового катализа, при более высоких концентрациях ( 10 нМ и в частности при физиологических) АТФаза работает в режиме трех центрового катализа.

В настоящее время экспериментально доказана гипотеза, что каталитическая активность АТРсинтазы непосредственно связана с вращением ее ротора (у субъединицы) [64-96]. Энергозависимое вращение субъединицы у внутри комплекса сезрз вызывает согласованное изменение конформации всех трех каталитических субъединиц Д что, в конечном итоге, обеспечивает работу фермента [26-31,54-56,51,64-66,76,82,87,88]. Представления об FoFi-АТФсинтазе как молекулярной машине, работа которой связана с вращением ее «ротора», хорошо согласуется с особенностями ее структурной организации. В F0Fr АТФсинтазе можно выделить две группы белковых субъединиц - «статор» (неподвижен относительно мембраны) и «ротор» (вращающийся внутри статора) [66,68,89]. Статор включает в себя гексамер ссзРз и связанную с ним субъединицу 5, а также мембранную субъединицу а и две субъединицы Ь, выступающие из мембраны и соединенные с комплексом а рз- В этой макромолекулярной конструкции субъединицы Ъ играют роль своеобразного кронштейна, связывающего неподвижные субъединицы комплексов FQ И FJ. Ротор состоит из субъединиц у, є и погруженного в мембрану кольца сп. Гидрофобное кольцо сп примыкает к расположенной в мембране субъедииице я. Субъединица у, входящая в состав ротора, не может свободно, то есть за счет энергии тепловых движений, вращаться внутри комплекса а3рз- Этому препятствуют стерические ограничения, поскольку эксцентричная субъединица у, вращающаяся в полости гексамера азрзі неизбежно должна зацепляться за «неровности», образованные субъединицами а и р. В режиме синтеза АТР источником энергии для направленного вращения ротора является энергия «протонного потенциала» - разности электрохимических потенциалов ионов водорода, переносимых через АТРсинтазу. В режиме гидролиза АТР источником энергии для вращения ротора служит энергия, запасенная в молекуле АТР [18,19].

Теоретические модели мотора Fi-АТФазы

В 1961 году Питером Митчеллом была предложена химиосмотическая гипотеза, в которой он постулировал связь между мембранным электрохимическим потенциалом и синтезом АТФ. Предложенный П.Боером в 1977 году механизм «переменного сродства» отвечает, как энергия протонного тока через фактор F0 конвертируется в энергию АТФ в фаісгоре Fj. Согласно этому механизму каждая из трех каталитических р субъедипиц в АТФ синтазе попеременно колеблется между состояниями с различным сродством к нуклеотидам. Он предположил, что физическое вращение центральной у субъединицы является причиной последовательных изменений. В 1997 году эти предположения были подтверждены расшифрованной Уоккером структурой.

Несмотря на огромное число экспериментальных исследований, адекватной математической модели работы этого мотора все еще не построено. На данный момент все работы можно разделить на три группы: первая - построение кинетических моделей (в рамках кинетики Михаэлис-Ментена). В данных работах [98-101] фермент-субстратный комплекс рассматривается как черный ящик, его работа характеризуется измеряемыми в эксперименте кинетическими параметрами (константы диссоциации, посадки/выхода субстрата из активного центра и т.д.). В некоторых моделях [101] учитывается кооперативность химических процессов в ферменте. То есть состояние одного из активных центров (наличие того или иного субстрата в АЦ и конформация данного центра) влияет на скорость протекания реакции (посадки/выхода лиганда, реакции гидролиза/синтеза) в другом АЦ. При этом полная кинетическая схема содержит до 5J =125 состояний (в трех центровой модели катализа каждый из трех АЦ может быть связан с АТФ, АДФ+Pj, АДФ, Pj либо быть свободен). Здесь и далее под термином «химическое» состояние мы будем понимать наличие того или иного субстрата в активном центре. Проблема сводится к решению задачи о скорости переходов между состояниями. Такие модели позволяют получить адекватные зависимости средней по ансамблю скорости от макропараметров, таких как концентраций субстратов, электрохимического потенциала и.д. но данные модели не позволяют последить за поведением отдельного молекулярного мотора и анализировать его поведение на отдельных этапах каталитического цикла.

Вторая группа исследователей пытается описать работу мотора исходя из «первых принципов», используя методы молекулярной динамики и квантовой механики [102-104]. Однако из-за огромной сложности задачи, даже с использованием мощностей современных суперкомпьютеров, удалось проследить динамику работы мотора лишь на очень коротких отрезках времени, порядка сотен пикосекунд. Что абсолютно недостаточно для описания работы всей белковой машины, учитывая то, что характерная скорость вращения мотора составляет несколько десятков (сотен) герц, т.е. характерная динамика, находится в другом временном диапазоне. Тем не менее, с использованием этих методов, удалось ответить на вопрос как именно, происходит процесс гидролиза в каталитическом центре, определены основные стадии гидролиза, определенны какие именно, атомы АЦ участвуют в этом процессе. Квантово механический расчет показал что во время гидролиза у-фосфат подвергается атаке двух молекул воды. Так же были получены энергии связи субстратов (АТФ, АДФ, и т.п.) с атомами аминокислотных остатков активного центра в различных конформациоиных состояниях каталитического центра, что конечно полезно для построения более простой модели, которая, тем не менее, учитывает все характерные особенности этого мотора. Было смоделировано изменение конформации (3 субъединицы в результате посадки АТФ и гидролиза АТФ. Несмотря на точность расчетов, они не дают общей картины понимания базовых принципов работы мотора Третья - самая интересная на наш взгляд группа работ. В них движение мотора рассматривается как диффузия материальной точки в одномерном потенциале, задача решается с использованием формализма Лапжевена. Потенциал же в уравнении для определения положения мотора в пространстве определяется «химическим» состоянием мотора, то есть типом фосфопуклеотида находящимся в АЦ. Каждому возможному «химическому» состоянию мотора ставится в соответствие феноменологический потенциал, построенный из общих соображений. Скорость переходов определяется опять же кинетическими параметрами (константами скорости посадки выхода субстратов и продуктов реакции). Интересны работы таких авторов как Kinisita К Jr, Kengo Adachi, Н Itoh, Oster [87,88,97,105-113]. Наибольших успехов на этом поприще добилась группа Остсра [105-112]. Их модель работы мотора, позволила описать направленное вращение ротора АТРсиптазы. В частности, ими была смоделирована зависимость кинематических параметров (например, средней угловой скорости вращения ротора) от концентрации субстратов. Хотя авротами для объяснения направленного движения ротора во время гидролиза АТФ и строятся модельные потенциалы, но вся работа мотора рассматривается как переходы в дискретном пространстве 43 = 64 возможных состояний мотора -четыре возможных «химических» состояний (свободный центр, АТФ, АДФ+Р[, АДФ) для трех активных центров. Переходы между состояниями рассматриваются как Марковский процесс. Коэффициенты в матрице переходов определяются кинетическими константами, углом поворота ротора и уровнями энергии соответствующими 64 четырем возможным состояниям. Таким образом, сам вид потенциалов для данной модели роли не играет, дискретность вращения и паузы в движения у субъединицы в положениях 90 и 30, закладывались изначально в модель через значения коэффициентов в матрице переходов между возможными состояниями. По сути, это также кинетическая модель.

Конформационпые состояния фермент-субстратного комплекса.

В нашей работе мы рассматривали изменения энергии электростатических взаимодействий для молекулы фермента, у которой в каждый момент времени каталитические центры находятся в различных состояниях (рис. 1.5.), обозначаемых Д, Д и Д. Эти состояния соответствуют трем разным конформациям примыкающих друг к другу субъединиц а и Д участвующих в формировании активных центров. Координаты атомов субъединиц ар, отвечающих конформации Д, мы брали из базы данных для кристаллографической структуры [32] (или [42]) для субъединиц, формирующих «закрытую» конформацию каталитического центра, содержащего AMPPNP (негидролизуемый аналог ATP). Конформацня Д соответствует соседним субъединицам р и а, формирующим другую «закрытую» конформацию каталитического центра, в котором содержится МдАДФ. Конформация Д, соответствует открытой конформации субъединицы Д не содержащей нуклеотидов в каталитическом центре. Координаты атомов молекул MgATP и MgAДФ, помещаемых нами в «открытый» каталитический центр ре были выбраны согласно их геометрии, известной из кристаллографических данных для каталитических центров Д и Д, соответственно. Положения MgATP, ГУ АДФ И НР042 В каталитических центрах Де(Т) и Де(0-Р), соответствующие переходному состоянию фермент-субстратного комплекса, были выбраны нами в согласии со стерическими ограничениями. Мы предполагали, что изменения конформации всех субъединиц аир, сопровождающиеся вращением субъединицы у, происходят согласованно. Поэтому в каждом состоянии фермент-субстратного комплекса, рассматриваемом в настоящей работе, один каталитический центр всегда находится в конформации Д (рис. 1.5 слева), другой центр - в конформации Д (рис. 1.5 посередине), а третий центр - в конформации Д, (рис. 1.5 справа). В нашей работе были рассчитаны значения электростатической составляющей полной энергии фермент-субстратного комплекса на различных стадиях каталитического цикла гидролиза АТФ. Ключевые стадии каталитического цикла, соответствующие связыванию ЛТФ и следующих за этим конформационных изменений всех трех каталитических центров АТФазы, которые соответствует трех-центровой модели работы АТФазы, показаны на рис. 2.1. На рис. 2.2. представлена диаграмма, на которой показано как изменяется электростатическая составляющая энергия системы на разных стадиях каталитического цикла, соответствующего трех-центровому механизму гидролиза АТФ.

В начальном состоянии («Состояние 1»), один каталитический центр АТФазы находится в «закрытой» конформации Д и содержит MgATP (этот центр обозначен как Д(Т)). Второй каталитический центр имеет «закрытую» конформацию Д и содержит М АДФ; для этого центра используется обозначение р$5). Третий каталитический центр свободен (не содержит нуклеотида и Pj); этот центр соответствует «открытой» конформации fie, в отсутствие субстрата он обозначен как Д(-). При избытке субстрата ( 1 мМ МАТФ) «Состояние 1» является короткоживущим промежуточным состоянием АТФазы, которое характеризуется высоким сродством к MgAT t» (К0 1мМ). Результаты наших расчетов находятся в хорошем согласии с этим предположением. Из рис. 2.2 видно, что связывание К АТФ с ферментом, находящимся в «Состоянии 1», сопровождается заметным снижением энергии фермент-субстратного комплекса (переход «Состояние 1» - «Состояние 2»). На основании данных рентгеноструктурпого анализа [32] можно предположить, что связывание субстрата (MgATO) с открытым каталитическим центром Д(-) инициирует конформационные изменения в субъединице Д(Т), сопровождающиеся кооперативными структурными перестройками всей молекулы фермента [26,27,31,66,64,68,88,106-112]. В субъединице Д как известно [32, 106-112], можно выделить два крупных домена, соединенных «шарниром». Предполагается [26-31,87,106], что энергетически выгодное связывание MgATO с субъединицей Д, сопровождается заметным изменением угла наклона между этими доменами (рис. 1.4). Это предположение хорошо согласуется с упомянутыми выше представлениями Л.А. Блюмснфельда о механизмах ферментативного катализа [1-3]. Дальнейшее развитие событий, инициированных связыванием МцАТФ, могло бы протекать по двум возможным сценариям, показанным на рис. 2.2 (модель А и модель Б). Различия касаются, в основном, того, какая стадия каталитического цикла непосредственно следует за связыванием АТФ -вращение субъединицы у (модель А) или гидролиз АТФ (модель Б). В литературе нет однозначного ответа на этот вопрос, поэтому в наших расчетах мы рассмотрели обе возможности. Согласно первому сценарию (модель А), часть энергия, освобождающейся после связывания MgATP к открытой каталитической субъединице (переход &(Г)й(0)ре(-) + MgATP - pt(T)l)t(D)fie(T)\ используется для вращения субъединицы у внутри комплекса ансамбля афі (структурный переход J3t(T)fi(D)j3e(T) - pt(T)pe(D)/]t(T)).

Согласно структурным данным [106,26,32], сгибание субъедшшцы ft может создавать удар (stroke), приводящий к вращению субъединицы у и к соответствующим кооперативным изменениям конформации остальных субъединиц АТФазного комплекса. Существуют функциональные доказательства того, что непосредственное взаимодействие между субъединицами f$и /которое ответственно за энергетическое сопряжение в F]Fo- АТФсинтазе у Е. coli, происходит на консервативном участке субъединицы (1 (p3S0DELSEED386), включающем аминокислоту p-Glu381, и Arg242 субъединицы ,/[61,65,88]. Наши расчеты показали (рис. 2.3 модель А), что переход «Состояние 2» — «Состояние 3» является энергоакцепторным процессом, что должно препятствовать самопроизвольной реализации этого процесса, Можно, однако, предположить, что оба перехода, «Состояние 1» — «Состояние 2» (энергодонорный процесс) и «Состояние 2» — «Состояние 3» (энергоакцепторпый процесс), происходят кооперативно. Это означает, что энергия, которая может выделиться в ходе первого процесса, не рассеивается полностью в тепло, а используется для реализации второго процесса. В соответствии с представлениями о механизмах ферментативного катализа, развитыми Л.А.Блюмеифельдом [1,2], сопряжение энергодонорного (переход «Состояние 1» -» «Состояние 2») и энергоакцепторного (переход «Состояние 1» Состояние 2») процессов можно объяснить существованием выделенных («механических») степеней свободы рассматриваемой нами макромолекулярпой конструкции. Таким образом, благодаря конструктивным особенностям системы обеспечивается энергетическое сопряжение: удар, вызванный изгибанием субъединицы р в результате энергетически выгодного связывания АТФ с открытым центром Ре( ), обеспечивает энергоемкий процесс вращения субъединицы у.

Результаты численного моделирования работы мотора по вращению нагрузки

На следующем шаге по времени последовательность операций повторялась. Таким образом, на базе кинетических уравнений, мы могли моделировать поведение отдельного мотора (одной «реализации»). Для описания усредненных характеристик (например, скорости химических реакций осуществляемых каталитическими комплексами), необходимо провести моделирование ансамбля моторов, т.е. провести усреднение по множеству отдельных реализаций. 3.4. Результаты численного моделирования работы мотора по вращению нагрузки. При численном решении системы (3.1)-(3.4), мы полагали, что в начальном состоянии реакционные центры свободны от субстратов. Т.е. начальные вероятности заполнения активных центров равны нулю. При моделировании работы мотора по вращению нагрузки (т.е. работа за счет энергии гидролиза АТФ) предполагалось, что концентрацией АДФ во внешней среде можно пренебречь (nADP = 0). Поскольку значения констант скоростей посадки и выхода субстратов варьируются в широких пределах [98-101,106,108], в расчетах мы использовали следующие значения: При выборе значений параметров мы исходили из следующих соображений: так как для к А1Т расхождения в оценках минимальны мы приняли его равным 4х106счМч. При выборе остальных рассуждали следующим образом: поскольку скорость гидролиза ненагруженной составляет примерно 300 молекул в секунду, таким образом, среднее время одного химического цикла (посадка АТФ, гидролиз, выход продуктов распада) в одном из трех каталитических центров примерно равно т т АГ1,+тн+т_лйР Ю 2с, АДФ одного порядка [98-101] мы приняли k+ADP=0.5k+Ajr поскольку сродство к АТФ все же выше чем к АДФ мы предположили, что скорость выхода АТФ должна быть ниже, чем скорость выхода АДФ к_ЛТР = 0.5к АГ Р. На рис.3.4 представлены рассчитанные нами реализации зависимости угла поворота у субъединицы от времени при различных концентрациях АТФ. Из графиков видно (3.4) что при низких концентрациях АТФ в работе мотора возникают значительные паузы, причем отчетливо видны скачкообразные повороты на 90 и 30. С увеличением концентрации происходит сокращение пауз между переходами 30 и 90 и, при достаточно высоких концентрациях АТФ, эта пауза становится практически не заметна и сливается с переходом в 30. Это связано с тем, что длительность паузы между переходами в 90 и 30 (АДФ-пауза), обусловлена скоростью химической реакции, протекающей в закрытом кармане, которая не зависит от концентрации АТФ во внешней среде [80]. Однако пауза между 30 и 90 обуславливается временем посадки АТФ в реакционный центр, назовем ее АТФ-пауза. В случае если посадка АТФ реализуется за время поворота в 120, то таких пауз в работе мотора вообще не возникает. Этим же объясняются сдвоенные переходы, когда между парой 120 шагов паузы вообще не наблюдается. При очень низких концентрациях АТФ иногда в работе мотора возникают повороты в обратном направлении, в результате чего скорость работы мотора падает.

В отдельных реализациях при низких концентрациях АТФ наблюдаются преимущественно АТФ-паузы что обусловлено ожиданием посадки АТФ в АЦ (рис.3.5.а). При высоких концентрациях паузы наблюдаются перед поворотом на 30 что обусловлено АДФ ингибированием (ожиданием выхода АДФ) (рис.3.5.в). При промежуточных концентрациях отчетливо видны и АТФ- и АДФ-паузы (рис.3.5.6). Поскольку посадка, выход и взаимные превращения фосфонуклеотидов (АТФ, АДФ и неорганического фосфата) носят случайный характер, то вращение ротора также носит стохастический характер. Для вычисления средней скорости мы делили количество оборотов на время реализации. Когда при некоторых значениях коэффициента трения и концентрации АТФ в движении ротора возникают значительные паузы (АДФ ингибирование [86,88,91]) при вычислении средней скорости вращения мы не учитываем время таких длинных пауз, т.е. мы высчитываем скорость только когда мотор находится в устойчивом состоянии вращения [86,88].