Введение к работе
Актуальность исследования механизмов, переноса электрона в фо-тосинтетическшс РЦ связана с фундаментальностью проблемы изучения их уникальных функциональных свойств, с широкими возможностями реализации, результатов - в частности, для дальнейшего развития теории, электронного транспорта в биологических системах, для непосредственного практического применения принципов функционирования, и самих макромолакулярных комплексов в конкретных фатопреоб-разуїощих устройствах.
Многочисленные эксперименты, проведенные на модельных системах, убедительно -показати, что на реакционную способность и эффективность взаимодействия редокс-компонентов фотосинтстпческих электрон-транспортных цепей решающее влияние оказывает их окружение (Замараев, Хайрутдинов, IS86;. Іііафирович, Шилов, 1Э86; Боровков и др., 1989; Pujtta et al., 1982; Boxer et al.,1985; Heltele et al., 1985;Miller,1985|ffaaielewaki,1988).0HO определяет расстояния меяду реагентами, их необходимую ориентацию,, полярность и другие детали, молекулярной организации среды„ контролирующие направленность и скорости, переноса электрона. В природных комплексах РЦ роль этого окружения выполняет белок. Однако, вплоть до недавнего времени считалось, что фотослнтегнческие белки, в основном, выполняют только функцию носителя связанных с ними редокс-кофакторов, эффективность переноса электрона меаду которыми регулируется главным образен/, высокочастотными внутримолекулярными колебаниями самих переносчиков, акцептирующими часть энергии переносимого электрона (Peters et al., І978; De Vault, 1980; Jortner, 1980). Вместе с тем, дальнейшее развитие исследовании, особенно стимулированное изучением температурных зависимостей электрон^-транспортных процессов в ЕЦ, показа-' ло, что адекватная физическая картина функционирования этих коїш-
лексоа должна, по-видимому, обязательно учитывать также и роль низкочастотных движений белка (см., напр.; Kakitani, Kakitani, 1981; Klrmaier et al., 1985;. Рубин а др., 1987). При этом, как начинает вырисовываться, значение последних скорее всего значительно пире, чем просто возможность внесения определенного, пусть даже существенного, вклада з процессы диссипации части энергии при стабилизации переносимого электрона на. редокс-косіакторах. Важнейшая роль динамической организации структуры РЦ могла бы заключаться в том, чтобы служить основой для реализации конкретных реакци-ояноспоообных состояний системы, эффективно контролирующих функциональную активность. В этой случае просматривается определенная аналогия с традиционными каталитическими белками, реакционная способность которых неотделима от их динамической организации, ее тесной связи, с состоянием окружения, составляющим, вместе с самим белком единое взаимодействующее целое. Можно ожидать, что и в комплексах фотосинтетических РЦ тонкая сбалансированность их динамической макромолекулярной структуры могла бы выполнять ключевую роль для точной "настройки" согласованно протекающих функциональных электрон-транспортных процессов.
В связи с этим основной целью настоящей работы явилось исследование конкретной роли, структурной лабильности фотосинтетических Щ а их функционировании на различных этапах разделения разноименных электрических зарядов, влияния окружения РЦ и ряда физико-химических факторов, на структурног-динамическое состояние этих макро-молекулярных комплексов и их электрон-транспортную активность.
Объектом исследования были изолированные РЦ и фатосинтетичесг-кие мембраны пурпурных бактерий, а также хлоропласти высших растений.
Были поставлены следующие задачи;
исследовать, основные пространственные характеристики фотопре-образующих комплексов бактериального типа, изолированных в водно-буферное, окружение и в пленках Ленгыюра-Блоджет , влияние состава растворителя на эти. характеристики;
детально исследовать электрон-транспортные процессы между редане- компонентами. РЦ пурпурных бактерий, начиная с сверхбыстрых пико-наносекундных стадий электронного переноса, в условиях направленной модификации структурно-динамического состояния препаратов;
провести, параллельные исследования в аналогичных условиях кон-фориацдонной динамики образцов, используя набор эндо- и экзогенных
индикаторов подвижности различных областей препаратов в различных времешшх диапазонах;,
детально изучить роль температурного и гидратационного факторов в регуляции фотохимической активности РЦ,
а также оценить влияние а7.ф;ифпльного окружения РЦ в изолированном и мембрано связанном состоянии на функцпоїшрование различных звеньев электрон-транспортной цепи данных комплексов;
исследовать возмо.тауа роль структурно-динамического состояния в функционировании РЦ фотосистемы Ц высших растений и участия в процессах регуляции их акт:шности внутркмембранных электрических ' полей.
Научная новизна. В работе впервые определены размеры и форма двух белково-пигыентных комплексов бактер;іального типа - РЦ нь. ephaeroidea и РЦ-цитохрамного комплекса Chr. rainutiaaimum, изолированных в водно-буферное окружение. Показана возможность влияния состояния растворителя на размеры комплексов.
Всесторонне обосновано наличие начального.и релаксирозашюго состояний пон-радш;альной пары РЦ пурпурных бактерий и участие внутрибелковых водородных связей в релаксационном процессе, сопровождающем временную стабилизацию ион-раднкальшх фотопродуктсв.
Показано, что реакции с участием хинонішх акцепторов зависят от возмокности локальных конф.ормационкых изменений РЦ в связи с изменением, зарядового состояния переносчиков электрона и варьированием внешних условий;, построена кинетическая модель процессов, учитывающая конформационше перестройки комплексов. Показано, что температурные эффекты в реакциях электронного переноса в РЦ, включая начальные процессы, могут быть связаны преимущественно с кои-формацианшми степенями свободы. Оценены термодинамические характеристики отдельных кошТюрмационных состояний РЦ и характерные времена переходов РЦ между конформациями,. регулирующими перенос электрона мезду первичным и вторичным хинонами.
Установлена корреляция между характером внутримолекулярной подвижности различных областей РЦ и активностью отдельных звеньев, электрон-транспортной цепи. Исследовано влияние структурно-динамического состояния амфифильного окружения РЦ на функционирование различных участков электрон-транспортной цепи этих комплексов.
Впервые проведено многостороннее исследование с привлечением.-комплекса методов радио- и оптической спектроскопии динамика различных структурных компонентов фотосинтетического аппарата пурпур-
4 ных бактерий и. функциональной активности отдельных звеньев электрон-транспортной цепи РЦ в зависимости от степени, гидратации препаратов - мембранного уровня организации и изолированных при помощи различных детергентов РЦ.
Впервые изучено влияние постоянного внешнего электрического поля на термолвшшесценцию хлоропластов высших растений. Показано, что- процессы фиксации фоторазделенных зарядов в фотосистеме II также могут зависеть от различных структурных состояний фотосинтетического аппарата, переходы ме;хду которыми управляются, в частности, внутримембранными электричесюиж полями.
Практическая значимость. В работе всесторонне раскрыта роль структурно-динамической организации фстсепшгетического аппарата в процессах высокоэффективного преобразования световой энергии реакционными центрами. Эта имеет не только (фундаментальное значение для развития теории электрошю-кошрормационных взаимодействий и биокатализа в целом, но и для. биотехнологических задач. Исследована возможность практического применения бактериальных РЦ в качестве элемента новых фотопреобразующих устройств. Отработаны методики получения ориентированных пленок активных РЦ и предложен макет высокочувствительного спектрального устройства на их основе. Впервые получены ориентированные многокомпонентные мультислойные структуры с участием активных РЦ-цитохромяых комплексов бактерий, что открывает реальные возможности конструирования упорядоченных молекулярных ансамблей с заданными свойствами. Па примере исследования эффектов миллиметрового излучения нетешіовоіі интенсивности показана возможность эффективного использования фотосинтетических РЦ в качестве чувствительных тест-систем внешних воздействий, влияющих на структурно-динамическое состояние функциональных белков.
Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались на 9 конференции ревз сБудапешт, 1974), симпозиуме "Пиг- мент-белковые комплексы в фотосинтезе" (.Познань, 1975), венгерско-польском, симпозиуме (Сегед, 1977),, междунарадной конференции па квантовой химии, биологии и фармакологии (.Киев,. 1978), международной конференции, по воде и ионам в биологических системах (Буха-реет, 1980), на I Всесоюзном биофизической съезде (Москва, 1982), 4-ой конференции по люминесценции (Сегедг ВНР, 1982), международной конференции по применению эффекта Ыессбауэра (Ал-ма-Ата.1983), международной школа по физике ионной сольватации (Львов, 1983), 1-ой Всесоюзной конференции "Кинетика и моханизші электронного
переноса в белковых системах и их моделях" (Вильнюс, 1985), 4-ой Всесоюзной шкале "Применение лазеров в биологии" (Кишинев, 1986), Всесоюзной конференции "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторних процессов" (Минск, I988JL 5-ом советскс—ивейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции" (Рига, 1988),. 6-ой и 7-ой конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1988, 1991), Всесоюзной конференции "Преобразование световой знергии в фотосин-тезирующих системах и их моделях" СПущина, 1989), 8-ой Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Звенигород, 1990), 2-ом съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990),, конференции по биофизике мембранных процессов (Опа-тия, Югославия, 1990), международном симпозиуме "Миллиметровые волны нетепловоп интенсивности в медицине" (Москва, 1991).
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 54 печатных работах, а также тезисах перечисленных выше конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает общее введение, раздел "объекты исследования", 6 глав с изложением, экспериментальных данных и их обсуждением, выводы. Материал работы изложен на 3??.стр. машинописного текста, содержит 61 рисунок " 24 таблицы. Количество цитируемых работ - 3 69.