Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы 6
Глава 1. Липидные и липид-белковые микродомены 6
Глава 2. Механика мембран 16
CLASS Часть II, Линейное натяжение и энергия взаимодействия в приближении прямой границ CLASS ы 21
Глава 1. Постановка задачи 21
Глава 2. Деформации наклона и растяжения/сжатия 36
Глава 3. Деформации наклона и поперечного изгиба 45
Глава 4. Деформации наклона, поперечного изгиба и растяжения/сжатия 79
Часть III. Рафт конечного размера 89
Глава 1. Энергия границы рафта произвольного размера 89
Глава 2. Распределение рафтов по размерам 97
Глава 3. Результаты и их обсуждение 100
Заключение 110
Выводы 114
Приложение 1. Непрерывность нейтральной поверхности на границе рафта 116
Приложение 2. Амплитуда тепловых флуктуации формы границы рафта 118
Список публикаций 121
Список литературы
- Механика мембран
- Деформации наклона и растяжения/сжатия
- Деформации наклона, поперечного изгиба и растяжения/сжатия
- Распределение рафтов по размерам
Введение к работе
Мембранным белкам для эффективного функционирования, как правило, требуется специфическое липидное окружение, состав и физико-химические свойства которого резко отличаются от интегральных свойств и состава плазматической мембраны. В частности, с белками ассоциированы участки бислоя (домены), обогащенные холестерином и сфингомиелином. Эти домены стабильны, т.е. существуют длительное время, и перемещаются в мембране, как единое целое, В англоязычной литературе эти микродомены носят название рафт ("raft"), что означает «плот». Большой интерес к исследованию рафтов связан с тем, что они необходимы для протекания многих жизненно-важных процессов, таких как внутриклеточная передача сигналов, эндоцитоз, сортировка и доставка белков из аппарата Гольджи в плазматическую мембрану и т.п. Исследование свойств рафтов in vivo сильно затруднено, поскольку их размер крайне мал и составляет 10 - 100 им (Pralle et al., 2000). Однако в искусственных бислойных мембранах, близких по составу к клеточным, но не содержащих белков, в результате фазового перехода возникают холестерин-сфингомиелиновые домены микронного размера. Такие домены могут быть исследованы современными экспериментальными методами и используются, хотя и с некоторыми оговорками, в качестве модели рафтов клеточной мембраны. В экспериментах на модельных бислойных мембранах было установлено, что рафты имеют практически круглую форму, бислойны, и липид в них находится в жидком состоянии. Круглая форма рафта довольно быстро (за секунды) восстанавливается после ее возмущения, что говорит о том, что на границе рафта имеется существенное линейное натяжение. Кроме того, толщина рафтов на 0,5-1 им превышает толщину окружающей их мембраны. Согласно последним данным, полученным методом ЯМР, в искусственных системах также возникают рафты, размеры которых составляют 10-100 нм.
Несмотря на большое число экспериментальных и теоретических работ, посвященных исследованию рафтов, физические механизмы, определяющие возникновение и динамику рафтов как в биологических, так и в искусственных системах до сих пор не выяснены. Это обуславливает актуальность теоретического исследования данного явления.
Распределение рафтов по размерам определяется конкуренцией граничной энергии и конфигурационной энтропии. Рост рафтов в размере и образование макроскопической фазы приводят к уменьшению суммарной длины их границы. С другой стороны, уменьшение числа доменов энергетически невыгодно, поскольку ведет к уменьшению конфигурационной энтропии, которая, напротив, стремится максимально диспергировать систему. Таким
образом, вопрос о величине линейного натяжения и его зависимости от размера рафта является ключевым для описания фазового разделения как в биологических, так и в модельных системах.
Поскольку белки присутствуют в плазматической мембране в составе рафтов, возможность их кластеризации во многом зависит от того, каким образом рафты взаимодействуют между собой. В связи с этим исследование механизмов взаимодействия рафтов становится особенно актуальным. Имеющиеся экспериментальные данные, полученные в модельных системах, указывают на то, что на коротких расстояниях между рафтами проявляется отталкивание, затрудняющее их слияние. Выяснение условий и причин такой кинетической стабилизации является важным для описания процессов кластеризации мембранных белков.
Работа посвящена расчету линейного натяжения и энергии взаимодействия рафтов. Именно эти физические характеристики в первую очередь определяют стабильность как индивидуальных рафтов так и их ансамблей. В связи с различием толщины рафта и окружающей мембраны вблизи границы рафта возникают механические деформации, направленные на сглаживание скачка толщины. Энергия этих деформаций дает «упругий» вклад в линейное натяжение. Конкуренция механических деформаций, индуцированных границами двух близкорасположенных рафтов определяют энергию их взаимодействия. Подобный подход, основанный на анализе мембранных структур с точки зрения теории упругости, ранее позволил выявить существенные закономерности таких процессов, как слияние и деление мембран, образование пор в липидных бислоях и т.п. В настоящей работе этот подход применяется в наиболее общем случае учета трех возможных деформаций мембраны: наклона углеводородных хвостов липидных молекул к поверхности мембраны, латерального растяжения/сжатия и изгиба.
Линейное натяжение границы и энергия взаимодействия рафтов зависят от разности толщины, а также от механических свойств рафта и окружающей мембраны: модулей упругости и спонтанной кривизны их монослоев. Одной из задач данной работы является анализ влияния этих параметров на свойства границы, в частности, на ее механическую стабильность. Вычисление зависимости энергии взаимодействия рафтов от указанных параметров и от расстояния между рафтами необходимо для выяснения возможных механизмов стабилизации их ансамбля. Особый интерес представляет зависимость энергии границы от радиуса рафта. Для рафтов, размер которых существенно превышает характерную длину распространения деформаций в мембране, граничная энергия линейно зависит от радиуса. Однако при малых размерах естественно ожидать отклонения от
линейности, что может сказаться на поведении популяции рафтов малого размера. Исследование этого круга вопросов также является задачей данной работы.
Работа состоит из введения, трех основных частей (девяти глав), заключения и двух приложений. Часть I содержит обзор литературы. Часть II посвящена вычислению линейного натяжения и энергии взаимодействия рафтов в приближении, что их размер намного превышает характерные длины распространения деформаций в мембране. В Части III линейное натяжение вычисляется в случае рафта произвольного размера. Теоретические результаты, полученные в настоящей работе, сопоставлены с экспериментальными данными.
Механика мембран
Основные деформации мембраны. Структурные перестройки мембран сопровождают многие клеточные процессы, такие как эидо- и экзоцитоз, включающие слияние и деление мембран, образование липидных и липид-белковых пор, работа механочувствительных каналов и т.п. Энергия деформаций, возникающих при этих перестройках, является существенной, если не определяющей, характеристикой процессов.
Специфика механики липидных мембран состоит в ярко выраженном различии физических свойств в латеральном и нормальном направлениях — мембрана обладает анизотропией. Это свойство роднит ее с жидкокристаллическими средами. Как известно, жидкокристаллические среды, помимо обычных термодинамических и механических параметров — температуры, плотности и т.д., характеризуются также векторным полем единичных директоров, определяющим в каждой точке анизотропию среды. В трехмерной системе с постоянной плотностью именно пространственное распределение директоров определяет упругую энергию системы. Начала теории упругости жидких кристаллов заложены в классической работе Франка (Frank, 1958). Им было получено выражение для энергии единицы объема деформированного тела в предположении, что направление директора медленно (на расстояниях, намного превышающих молекулярные размеры) меняется по пространству: AF = -(divn)2+b.(nrotn)2+b.[nrotnf, (1.2.1) где п — единичный директор; К\, Кг, К$ — модули Франка. Деформации, в которых отлична от нуля только одна из величин div(n), n rot(n), [n rot(n)] называются поперечным изгибом, кручением и продольным изгибом, соответственно (Ландау и Лифшиц, 1987). Непосредственное использование выражения для энергии (1.2.1) для описания деформации мембран недопустимо, поскольку оно получено для объемной среды, в то время как свойства мембраны существенно определяются ее поверхностью. Теория жидких кристаллов применительно к мембранам была разработана Хельфрихом (Helfrich, 1973). Поверхность мембраны задается вектором единичной нормали N. Таким образом, можно перейти от распределения директора к распределению нормали и угла между нормалью и директором. Однако было показано, что отклонения директора от нормали очень быстро затухают, т.е. практически всегда n = N. Для жидкой изотропной однородной мембраны можно показать, что rot(n) = 0, и, следовательно, деформации кручения и продольного изгиба в мембране не возникают. Для малых деформаций энергия поперечного изгиба, отнесенная к единице площади мембраны, записывается в виде (Helfrich, 1973): И- = (div(N)+jJ-f Л =l(j-jj-ljl (1.2.2) где В — модуль изгиба; J = -div(N) — геометрическая кривизна; JQ — спонтанная кривизна мембраны. Дивергенция вычисляется вдоль поверхности мембраны. Таким образом, в подходе Хельфриха мембрана рассматривается как тонкая пленка, не имеющая внутренней структуры, и обладающая только изгибной жесткостью. Этот подход адекватен для описания явлений, пространственный масштаб которых намного превышает расстояния, на которых происходит затухание отклонения директора от нормали. Модель мембраны, как тонкой бесструктурной пленки, оказывается недостаточной при рассмотрении широкого круга явлений, в частности, таких процессов, как слияние и деление мембран, где характерные размеры составляют 1-10 нм. Попытки распространения подхода Хельфриха и на такие системы привели, в частности, к так называемому «кризису теории слияния» (Siegel, 1993) — из теоретических расчетов получалось, что мембраны практически никогда не должны сливаться, в то время как этот процесс происходит как в биологических, так и в модельных системах.
Учет наличия у мембраны внутренней структуры приводит к необходимости введения дополнительной деформации — наклона углеводородных цепей липидных молекул к поверхности мембраны. Формально это означает отклонение директора от нормали. Деформация наклона, как правило, характеризуется углом между директором и нормалью (Kuzmin et al., 2001; Markin and Albanesi, 2002) или вектором наклона t = n/(nN) - N = n - N (Hamm and Kozlov, 2000; MacKintosh and Lubensky, 1991). В случае малой деформации энергия пропорциональна квадрату угла или вектора наклона, соответственно. В работе (MacKintosh and Lubensky, 1991) энергия Wt t2, связанная с наклоном, просто складывалась с энергией изгиба (1.2.2). Более последовательный и детальный анализ одновременного действия поперечного изгиба и наклона, был проведен в работе (Hamm and Kozlov, 2000). В этой работе мембрана рассматривалась как трехмерная сплошная локально объемно несжимаемая среда. Монослой разделялся на слои, параллельные его поверхности, вычислялась энергия деформаций в каждом слое, которая затем интегрировалась по толщине мембраны. Полученное выражение для энергии, отнесенной к единице площади мембраны, имеет вид: W=Z{M )+JoY -r2o+±2, (1.2.3) где дивергенция вычисляется вдоль поверхности мембраны. Подставляя div(n) = div(N) + div(t) = -J+ div(t), получим W (j-J0-Mtf- +ft2- (1.2.4) В наличии div(t) в первом члене проявляется отличие подходов Хэмма-Козлова и МакКинтоша-Любенского. В своих вычислениях мы будем основываться на записи свободной энергии в форме (1.2.3). Помимо наклона и поперечного изгиба, мембрана может подвергаться также деформации растяжения/сжатия в латеральном направлении (Rawicz et al., 2000). Энергия такой деформации пропорциональна квадрату относительного изменения площади мембраны. В настоящей работе этот член также будет включен в выражение (1.2.3).
Величины упругих модулей. Для вычисления энергии деформаций наклона, изгиба и растяжения/сжатия необходимо знать соответствующие упругие модули. В работах (Evans and Rawics, 1990; Rawicz et al., 2000) в экспериментах по втягиванию гигантских однослойных везикул в микропипетку измерялись модуль изгиба и модуль растяжения/сжатия мембран из липидов с различными длинами и степенью насыщенности углеводородных цепей. Было получено, что величина модуля растяжения/сжатия слабо ( 10 %) изменяется при увеличении длины цепи от 13 до 22 углеродных атомов и составляет 120 мН/м (в расчете на монослой). Одновременно величина модуля изгиба возрастает в 4 раза — от 5 до 20 кТ (кТ 4-ІЇГ21 Дж); модуль изгиба для «обычных» липидов, как правило, считается равным 10 Ar(Kuzmin et al., 2001; Niggemann et al., 1995; Rawicz et al., 2000). Для вычисления модуля наклона в работе (Hamm and Kozlov, 1998) рассматривались переходы мембраны между инвертированной гексагональной (Нц) и инвертированной мицеллярной кубической (QJI) фазами. Результаты были получены только для диолеилфосфатидилхолина. Модуль наклона мембраны из этого липида равен 40 мН/м. Этот результат близок к оценкам, приведенным в работах (Cohen and Melikyan, 2004; Hamm and Kozlov, 2000; Kuzmin et al., 2001; May, 2002), согласно которым его величина приблизительно равна поверхностному натяжению на границе вода-масло, т.е. - 50 мН/м. Значения упругих модулей рафтов в настоящее время напрямую не измеряны. Для монослоев с высоким содержанием холестерина величина модуля растяжения/сжатия резко возрастает и может достигать 700 мН/м (Evans and Rawics, 1990; Needham et al., 1988; Needham and Nunn, 1990). Модуль изгиба также увеличивается примерно в 4 раза (Evans and Rawics, 1990). Однако было показано, что для липидов, находящихся в Ни фазе, увеличение модуля изгиба при добавлении холестерина может составлять всего 30-50 % (Chen and Rand, 1997). При этом неизвестно, в какой мере свойства таких монослоев имитируют свойства рафтов. Величина модуля наклона, по-видимому, не должна сильно зависеть от состава монослоя, поскольку согласно оценкам (Hamm and Kozlov, 2000; Kuzmin et al., 2001) она определяется поверхностным натяжением на границе гидрофобной части монослоя и воды, хотя экспериментальных данных, подтверждающих это соображение, в настоящее время нет.
Деформации наклона и растяжения/сжатия
В случае учета только деформаций наклона и растяжения/сжатия и запрещения деформации изгиба не может меняется угол между директорами. Вдали от границы директоры ориентированы вертикально, а, значит, такая ориентация сохраняется и во всем монослое (рис. 2.2.1). Таким образом, div(n) = 0, и необходимо рассматривать деформации только в направлении, нормальном к плоскости подложки. В этом случае элемент монослоя испытывает деформации растяжения/сжатия вдоль своей оси, которая всегда остается перпендикулярной границе раздела монослоев.
Энергия взаимодействия. Пусть два рафта с параллельными прямыми границами разделены полосой фонового монослоя шириной L = 2d. Введем декартову систему координат, центр которой расположен на подложке посередине между границами. Тогда граница левого рафта будет иметь координату х = -d, а правого — координату х = d. В такой системе координат, вид решения (2.2.4) вариационного уравнения (2.2.3), очевидно, не изменится.
Полная энергия в расчете на единицу длины двух границ W = Wr + Ws. Аналогично тому, как это было сделано при вычислении линейного натяжения, из условия непрерывности нейтральной поверхности выразим одну из неизвестных постоянных ст или cs, подставим в выражение для энергии и найдем минимум энергии по оставшейся постоянной. Форма нейтральной поверхности вблизи контакта двух монослоев разной равновесной толщины hr (слева) и h/ (справа) при учете деформаций наклона и растяжения/сжатия. Кривая построена для hr = 2 нм, h/= 1,5 нм, Ка = 100 мН/м, К, = 40 мН/м.
Из графика видно, что толщина мембраны при переходе через границу меняется монотонно. При вычислении линейного натяжения у не учитывалась кривизна кромки рафта, однако малая характерная длина затухания деформаций (2.2.14) делает теорию применимой для рафтов размером, начиная от десятков нм и выше, т. е. практически для любых макроскопических рафтов.
Величины упругих модулей рафта и фона. Упругие свойствами монослоя — модуль наклона и модуль растяжения/сжатия, сильно различаются для рафта и для окружающей мембраны. Заметим, что в промежуточном случае, когда только модуль растяжения/сжатия рафта К/ намного превышает модуль растяжения/сжатия фона К/, при одинаковых модулях наклона Kf = К?, выражение для линейного натяжения также дается формулой (2.2.16). Линейное натяжение для s- и /у-рафтов отличается в два раза. Действительно, в случае j-рафта нейтральные поверхности как рафта, так и фона на границе смещаются на величину SI2, и энергия пропорциональна 2-(( 2) .= all. Для pr-рафта на границе смещается только нейтральная поверхность фона на величину 4 и энергия пропорциональна а, что в два раза больше, чем в предыдущем случае. Когда рафт имеет промежуточную жесткость, линейное натяжение лежит в диапазоне между двумя предельными значениями (2.2.15) и (2.2.16). На рис. 2.2.3 приведена зависимость линейного натяжения /от разности толщины рафта и фона при hs = 1,5 нм для случаев: s- и jW-рафтов. Во втором случае, очевидно, рафт вообще не деформируется и, как это видно из (2.2.16), линейное натяжение зависит только от упругих модулей фона, которые считались равными Kas = Ка= 100мН/м и К,3 = К, = 40мН/м. Горизонтальная прямая на рис. 2.2.3 соответствует линейному натяжению - 1 пН, измерянному экспериментально в работе (Baumgart et al., 2003). Это значение достигается при 8- 1,5 А для pr-рафта и при S- 2,3 А для s-рафта, что слишком мало по сравнению с экспериментально измеряиной величиной -2,5-5 А (в расчете на монослой) (Rinia et al., 2001).
От величины линейного натяжения должна зависеть амплитуда тепловых флуктуации формы рафта: чем больше натяжение, тем меньше должны быть искажения. В Приложении 2 «Амплитуда тепловых флуктуации формы границы рафта» получена формула (А2.9), связывающая средний квадрат отклонения радиуса рафта с величиной у. Для рафта с характерным для модельных систем размеров Ro 10 мкм при у 1 пН отклонение радиуса составляет 30 нм, т.е. рафт является практически круглым, что находится в соответствии с экспериментальными данными (Samsonov et al., 2001). Энергия взаимодействия границ. В предыдущем разделе также было получено выражение (2.2.13) для энергии взаимодействия двух больших рафтов с параллельными границами. Также как и для линейного натяжения, можно выделить два предельных случая мягкого и бесконечно жесткого рафта.
Как видно из графиков, энергия взаимодействия убывает с уменьшением расстояния, т.е. между рафтами действует сила притяжения. При L - 0 энергия взаимодействия стремится к (-2у) (см. (2.2.13), (2.2.17)), т.е. полная энергия (2.2.13) стремится к нулю. Это связано с тем, что при L = 0 границы рафтов исчезают, и в системе остается один бесконечно большой рафт с нулевой энергией (т.к. его энергия была принята за уровень отсчета). Поскольку при большом расстоянии между границами их энергия положительна и равна 2у, и энергия монотонно зависит от расстояния L, рафты притягиваются, и, таким образом, придя в контакт, должны сливаться. Это действительно наблюдается в модельных системах. Однако в работе (Samsonov et al., 2001) обнаружено, что слияние рафтов происходит значительно реже, чем их столкновения, по-видимому, из-за короткодействующего отталкивания границ. Приведенный выше вид энергии взаимодействия (2.2.13), (2.2.17) не позволяет объяснить этих экспериментальных данных, а также существования ансамблей малых рафтов в модельных и клеточных мембранах. Глава 3. Деформации наклона и поперечного изгиба
В этой главе будем считать, что нейтральная поверхность является нерастяжимой. В этом случае в системе возможны только деформации наклона и изгиба. Учет этих двух деформаций является важньш с практической точки зрения, поскольку позволяет получить относительно компактные выражения для линейного натяжения границы и энергии взаимодействия рафтов, которые могут быть детально проанализированы. Кроме того, случай учета рассматриваемых двух деформаций оказывается достаточно близким к общему случаю всех трех деформаций. Действительно, для липидных монослоев различного состава без холестерина модуль растяжения/сжатия Ка « 120 мН/м (Rawicz et al., 2000) а модуль наклона Kt « 40 мН/м (Hamm and Kozlov, 1998). Для монослоев с высоким содержанием холестерина (т.е. рафтов) величина модуля растяжения/сжатия резко возрастает и может достигать - 700 мН/м (Needham et al., 1988; Needham and Nunn, 1990). С другой стороны, величина модуля наклона, по-видимому, не должна сильно зависеть от состава монослоя, поскольку согласно (Hamm and Kozlov, 2000) определяется поверхностным натяжением на границе гидрофобной части монослоя и воды и по порядку величины должна быть близка к 50 мН/м, хотя однозначных экспериментальных данных, подтверждающих это соображение, в настоящее время нет. Таким образом, величина модуля растяжения/сжатия значительно (в несколько раз) превышает величину модуля наклона, а значит энергетический вклад деформации растяжения/сжатия должен быть существенно меньше, чем вклад деформации наклона. Для иллюстрации этого утверждения рассмотрим две последовательно соединенные пружины с разными коэффициентами жесткости Ка и К,. Более жесткой пружине (Ка) соответствует деформация растяжения/сжатия, а более мягкой (К,) — деформация наклона. При растяжении системы обе пружины будут развивать равные силы, однако величина деформации жесткой пружины будет меньше, чем мягкой, в число раз, равное отношению коэффициентов жесткости пружин KJKa. Величины деформации входят в энергию квадратично, а упругие модули — линейно, поэтому вклад деформации более жесткой пружины в энергию будет в KJK, 3-17 раз меньше, чем вклад деформации мягкой пружины.
Деформации наклона, поперечного изгиба и растяжения/сжатия
Перейдем к рассмотрению самого общего случая действия всех трех деформаций: наклона, изгиба и растяжения/сжатия. Энергия деформаций дается непосредственно выражением (2.1,15). Для вычисления энергии единицы длины границы рафта — линейного натяжения — необходимо минимизировать это выражение в области рафта (х 0) и в области фонового монослоя (х 0). Вариация энергии по пространственному распределению деформаций наклона и растяжения/сжатия при фиксированных граничных условиях (невозмущенный монослои вдали от границы + непрерывная сшивка директора и нейтральной поверхности па границе) в области рафта и в области окружающей мембраны приводит к системе дифференциальных уравнений Эйлера-Лагранжа, Решение системы содержит неизвестные постоянные коэффициенты, часть которых определяется из граничных условий. Оставшиеся коэффициенты находятся минимизацией по ним полной энергии (2.1.15), что эквивалентно условию отсутствия сил и моментов на границе х 0.
Энергия полубескопечпого монослоя. Применяя алгоритм решения задачи, аналогичный описанному в Части II, Главе 3 «Деформации наклона и поперечного изгиба», рассмотрим сначала полубесконечпый монослой, расположенный в области х 0, обладающий спонтанной кривизной J0, равновесная толщина которого равна ho.
Четыре комплексных постоянных с\, сг, су, с эквивалентны восьми вещественным, что выглядит переопределением для дифференциального уравнения четвертого порядка с вещественными коэффициентами (2.4.6). Однако физически очевидное требование вещественности функции п{г) при произвольном г сокращает количество подлежащий определению вещественных констант до четырех. Налагая условия (2.4.2), что монослой невозмущен вдали от границы, из (2.4.8) получаем с2 = с4 = 0. (2.4.10)
Зная пространственное распределение директора (2.4.8), используя (2.4.5) и условие локальной объемной несжимаемости в виде (2.1,13), можно найти распределения относительного изменения площади нейтральной поверхности а(х) и отклонения толщины монослоя от равновесной фс).
Линейное натяжение границы раздела рафт/окружающая мембрана. Применим изложенный метод вычисления энергии полубесконечного монослоя с заданными граничными условиями для расчета линейного натяжения границы рафта. Ниже величины, относящиеся к рафту, будем снабжать верхним или нижним индексом «г» — raft, а величины, относящиеся к фоновому монослою — верхним или нижним индексом «S» surround.
Зависимость линейного натяжения границы рафта (в пиконьютонах) от величины несоответствия толщины б (в ангстремах), для случаев pr-рафта (кривая 1)и5-рафта (кривая 3) при Jt = Js 0. Пунктирные кривые 2 и 3 соответствуют линейному натяжению рг- и s-рафтов, вычисленному с учетом только деформаций наклона и изгиба (при К/, К/ - »). Значения параметров: В, = В = 10 кТ, К = К, = 40 мН/м, Ка « Ка « 100 мН/м.
Кривые построены при следующих значениях параметров: !JQ « 2 нм, Bs = В= 10 кТ = 4 10-20 Дж, Kf = К, = 40 мН/м, К/ = Ка= 100 мН/м. Уровню горизонтальной прямой соответствует линейное натяжение - 1 пН, полученное экспериментально из анализа формы сфингомиелин-холестериновых микродоменов в опытах на гигантских липосомах (Baumgart et al., 2003). Из графиков видно, что экспериментальное значение линейного натяжения - 1 пН достигается при S= 0,4 нм для случая s-рафта и при S— 0,27 нм — для случая /?/ -рафта? что согласуется с экспериментальными данными по атомной силовой микроскопии и рентгеновскому рассеянию (Gandhavadi et al., 2002; Rinia et al., 2001). Соответствующие значения при Kas, Kar - oo равны 0,32 нм и 0,23 нм. Отметим, что вычисленные значения линейного натяжения для случая трех деформаций примерно в полтора раза ниже, чем полученные значения для двух деформаций — наклона и поперечного изгиба — при той же разности равновесных высот рафта и фонового монослоя. Эта разница связана с тем, что учет третьей деформации (растяжения/сжатия) дает дополнительную степень свободы при компенсации несоответствия толщины, что приводит к уменьшению энергии. Такое различие может оказывать существенное влияние на описание кинетики рафтообразования и распределения рафтов по размерам.
Зависимость линейного натяжения s-рафта (в пиконьютонах) от величины S (в ангстремах) при различных значениях спонтанной кривизны. Пунктирные кривые построены для случаев Js = Jr = 0 (кривая la) и Js - ±0,1 нм" , Jr -Js (кривая 2) с учетом только деформаций наклона и изгиба. Сплошные кривые построены для случаев Js = Jf = 0 (кривая 16); Js = +0,1 нм 1, Jr = -Js (кривая 2а) nJs = -ОД нм"1, Jr = -Js (кривая 26) с учетом всех трех деформаций. Значения параметров как на рис. 2.4.1.
Из графиков видно, что все кривые, построенные с учетом трех деформаций лежат ниже соответствующих кривых, построенных с учетом только деформаций наклона и изгиба. Кроме того, в отличие от случая двух деформаций, величина линейного натяжения зависит от знака спонтанной кривизны. Это связано с тем, что в выражении (2.4.18) для линейного натяжения, помимо квадратичных по 5 и (Jr — Js) членов входит также и перекрестный член (Jr - JS)S, отсутствующий в аналогичном выражении (2.3.61) для случая деформаций наклона и поперечного изгиба. Заметим, что когда разность спонтанных кривизн рафта и фонового монослоя отлична от нуля, также как и в случае двух деформаций, существует диапазон значений 5, в котором линейное натяжение отрицательно. Поскольку спонтанная кривизна монослоя и его равновесная толщина определяются его составом, есть основания ожидать, что измеряемые экспериментально значения линейного натяжения должны сильно меняться для мембран из разных липидов.
Прямые построены при тех же значениях параметров, что и на (рис. 2.4.1). Из диаграммы (рис 2.4.3) видно, что диапазон спонтанных кривизн, в котором линейное натяжение положительно, при учете трех деформаций оказывается уже, чем в рассмотренном ранее случае деформаций наклона и поперечного изгиба. Это связано с тем, что появление дополнительной степени свободы — возможности изменять площадь нейтральной поверхности элемента монослоя — приводит к понижению энергии, необходимой для компенсации несоответствия толщины, в то время как энергетический выигрыш из-за релаксации внутренних напряжений монослоев, обусловленных наличием спонтанной кривизны, практически не меняется.
Полученные в данном разделе значения линейного натяжения оказались несколько ниже ( в 1,5 раза), чем вычисленные при учете пары деформаций наклона и поперечного изгиба при прочих равных условиях. Однако несмотря на количественные отличия, качественно результаты в этих двух случаях совпадают. В частности, форма мембраны в случае трех деформаций также оказывается осциллирующей с затуханием с незначительным изменением длины волны и длины затухания осцилляции. Энергетический барьер, препятствующий сближению двух рафтов, имеет место и при учете трех деформаций, хотя его высота несколько ниже.
Распределение рафтов по размерам
Постановка задачи, Отвлекаясь от механизма формирования доменов, рафты и окружающую их мембрану можно рассматривать как две несмешивающиеся двумерных жидкости. Термодинамическое равновесие в такой системе в первую очередь определяется балансом двух факторов — линейного натяжения на границы рафта и конфигурационной энтропии ансамбля микродоменов. Линейное натяжение делает выгодным слияние рафтов, поскольку при этом уменьшается их суммарный периметр, и, следовательно, связанный с ним вклад в свободную энергию. С другой стороны, уменьшение полного числа рафтов приводит к уменьшению конфигурационной энтропии системы, то есть к увеличению свободной энергии. Если превалирует вклад линейного натяжения, в мембране образуются макроскопические рафты, что, по-видимому, происходит в экспериментах на модельных мембранах. Напротив, если линейное натяжение мало, конфигурационная энтропия стремится увеличить количество рафтов, одновременно уменьшая их размер, и образуется множество маленьких рафтов. Таким образом, линейное натяжение оказывается основным фактором, определяющим пространственное распределение липидных компонент мембран, В настоящей главе будет рассчитана функция распределения рафтов по размерам с использованием энергии границы рафта конечного размера, вычисленной в предыдущей главе.
Описание системы. Рассмотрим изолированный участок липидного бислоя площади S, с существующей в нем популяцией рафтов различного размера. Пусть общая площадь всех рафтов фиксирована и равна Sr. Будем считать, что все рафты круглые, и их радиус изменяется дискретно — шаг изменения соответствует добавлению в рафт одной липидной молекулы. Введем минимально возможный радиус рафта rmin. Эта величина является условной и учитывает, что размер рафта ограничен снизу, по крайней мере размером одной липидной молекулы. Поскольку использование понятия линейного натяжения для одной липидной молекулы некорректно, выберем rmin таким образом, чтобы рафт минимального радиуса был объектом малым, но макроскопическим. Расчеты показывают, что если гтіп не слишком большой, то результаты не зависят от его конкретной величины.
Величины упругих модулей рафта и фона. В Части III, Главе 1 «Энергия границы рафта произвольного размера» были получены выражения (3.1.16) и (3.1.21) для энергии рафта и энергии окружающего монослоя в зависимости от значений граничного директора п и отклонений толщины и 4s ПРИ г = R и был описан алгоритм вычисления полной энергии границы в зависимости от радиуса рафта R. При вычислении значений энергии возникает вопрос о величине упругих постоянных — модуля наклона и модуля изгиба. Рассмотрим три варианта соотношения упругих модулей рафта и фона 1) s-рафт, когда упругие модули рафта и фона совпадают {Вг = Д, К[ = К,1); 2) рафт, когда только модуль изгиба в рафте увеличен по сравнению фоновым значением — Вг « ABS, К[ = К?; и 3) r-рафт, когда оба упругих модуля в рафте велики — ВГ« 4BS, К[ = 4К , аналогично рассмотренным в Части II Главе 3. Кроме модулей упругости, параметром, определяющим линейное натяжение или в общем случае энергию границы рафта является спонтанная кривизна как рафта так и фонового монослоя.
Энергия границы в случае нулевой спонтанной кривизны. Осцилляции энергии и директора. На Рис. 3.3.1, я приведена зависимость энергии границы (в расчете на бислой) 2Wот радиуса рафта R при нулевом значении спонтанной кривизны как рафта так и фона; несоответствие толщины 3= hr - hs = 4 А. Соответствующие этим кривым функции распределения рафтов по размерам, рассчитанные по формулам (3.2.4) и (3.2.6), приведены на Рис. 3.3.1, б. Кривая 1 построена для случая r-рафта, кривая 2 — для случая /рафта, кривая 3 — для случая л-рафта. Соответствующие прямые линии на Рис. 3.3.1, а построены с использованием выражения (3.1.24) и отвечают приближению большого рафта с прямой границей. Из графиков рис. 3.3.1, а видно, что энергия границы является нелинейной функцией радиуса.
Как видно из рис. 3.3.3, а и выражения (3.1.24), при уменьшении величины несоответствия толщины уменьшается линейное натяжение. Это приводит к относительному увеличению роли энтропийного члена в свободной энергии (3.2.3), и количество рафтов минимального радиуса должно возрастать (рис. 3.3.3, б). Однако одновременно увеличивается глубина минимума при R 6 нм, в результате чего в окрестности этой точки появляется пик функции распределения, то есть появляется термодинамически устойчивая популяция рафтов нанометровых размеров. Качественно этот результат согласуется с данными работы (Pralle et al., 2000), в которой было показано, что в плазматической мембране ВНК-21 клеток существуют стабильные белок-липидные рафты радиусом 26±13 нм. Полученное нами значение 6 нм существенно ниже экспериментального, хотя и совпадает с ним по порядку величины. Однако следует учесть тот факт, что наличие белка в составе рафта может существенно повлиять на зависимость граничной энергии от радиуса, например, за счет несоответствия толщины между бислоем рафта и трансмембранным участком белка. Так, если длина трансмембранного домена белка меньше толщины гидрофобной части бислоя, должна увеличиться глубина четных минимумов граничной энергии, что приводит к появлению максимумов функции распределения и появлению популяций рафтов больших средних размеров.
На Рис. 3.3.4, а представлена зависимость энергии границы 2W от радиуса рафта R, аналогичная представленной на Рис. 3.3.3, а, но для случая жесткого рафта (Br = 4BS, К[ = 4Kf), когда спонтанная кривизна фона равна нулю (Л = 0) при различных значениях спонтанной кривизны монослоя рафта Jr. Кривая 2 соответствует случаю нулевых спонтанных кривизн Jr = Js = 0; кривая 1 — случаю Js = 0,Jr = +0,1 нм ; кривая 3 — случаю Js = 0, Jf = -0,1 нм . Соответствующие прямые линии построены согласно выражению (3.1.24). Для этих зависимостей можно дословно повторить все замечания и выводы, сделанные по поводу кривых на Рис. 3.3,3, а — качественно поведение энергии в случаях мягкого и жесткого рафтов одинаково. Также на Рис. 3.3.4, б приведен пример распределения, соответствующего кривой 1. Б) Вариация Js при Jr 0. На Рис. 3.3.5 приведены зависимости энергии границы 2W от радиуса рафта R для положительной спонтанной кривизны рафта, Jr = +0,1 нм 0, в случае рафта {Вг = 45s, К[ = Kf) при следующих значениях спонтанной кривизны окружающей мембраны: Js = +0,1 нм" (кривая 2); Js = 0 (кривая 3); Js = -0,1 нм (кривая 1). Из Рис. 3.3.5 видно, что при изменении спонтанной кривизны фона имеет существенное значение ее знак. Как следует из выражения (3.1.24) при R — х появление любой спонтанной кривизны в любом монослое — как рафта, так и фона — приводит к понижению энергии границы.
Зависимость энергии границы/-рафта (в единицах кТ) от его радиуса (в нанометрах) при Jr = +0,1 нм и различных значениях спонтанной кривизны рафта. Js = +0,1 им" (кривая 2); Js = 0 (кривая 3); Js — -0,1 нм (кривая 1). Несоответствие толщины 5= 5 А.
Величина этого понижения определяется абсолютным значением разности {JSBS - JrBr). Отсюда видно, что понижение энергии будет большим, если спонтанные кривизны рафта и фона имеют разные знаки (кривая 1 на Рис. 3.3.5), меньшим — если одинаковые (кривая 2), и промежуточным, если одна из спонтанных кривизн равна нулю (кривая 3). Если спонтанные кривизны рафта и фона имеют разные знаки, то увеличивается глубина минимума на кривых зависимости граничной энергии от радиуса, что проиллюстрировано на (Рис, З.З.б, д) для случая/-рафта при Jr +0,1 нм и Js = -0,1 им" для различных величин несоответствия толщины: 5= 5,6 А (кривая 1), 5 5,8 А (кривая 2) и д= 6 А (кривая 3).
