Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. СТРУКТУРА ХРОМАТИНА II
1.1. Структурная организация нуклеосом II
1.2. Организация нуклеосом в нити диаметром
1.3. Роль гистона НІ в организации хроматина........ 26
1.4. Высший уровень'. организации хроматина 31
1.5. Тепловые свойства хроматина 35
ГЛАВА.II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.......... ........ 51
2.1. Методика дифференциальной сканирующей микрокалориметрии 51
2.2. Дифференциальный сканирующий микрокалориметр:
а) с вводными каналами; б) с разборной ампулой 59
2.3. Обработка экспериментальных данных 69
2.4* Характеристика препаратов 75
ГЛАВА III. МИКРОКАЛОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ СТРУКТУР БИОПОЛИМЕРОВ 77
3.1. Тепловые свойс тва растворов хроматина. 77
3.2. Тепловые свойства нуклеосом, нуклеосомного кора
и динуклеосом 83
ГЛАВА ІV. КАЛОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЛОЖНЫХ БИОЛОГИ
ЧЕСКИХ СИСТЕМ............ 98
4.1. Тепловые свойства хроматина в составе клеточных ядер 98
4.2. Тепловые свойства хроматина, входящего в состав клеток различных тканей *. 106
4.3. Термостабильность хроматина и ДНК опухоли 121
В Ы В О Д Ы 129
Литература 132
- Структурная организация нуклеосом
- Методика дифференциальной сканирующей микрокалориметрии
- Тепловые свойс тва растворов хроматина.
- Тепловые свойства хроматина в составе клеточных ядер
Структурная организация нуклеосом
Генетическая-информация всех живых систем за небольшим исключением (РНК-содержащие вирусы и фаги) закодирована в структуре ДНК. В каждой клетке молекула ДНК образует комплекс с белками. Этот комплекс для организмов, имеющих истинные клеточные ядра, называется хромати ном, ДНК хроматина связана с основными белками - гистонами и малым количеством кислотных белков - негистоновыми белками.
- Работы последних лет /45/ показали, что гистоны выполняют структурную роль в процессе функционирования хроматина. Гистоны делятся на 5 основных типов: лизин-богатые (HI или Н5).умеренно лизин-богатые (Н2А и Н2В) и аргинин-богатые гистоны_(НЗ -и Н4). Показано также,что длина ДНК хромосомы составляет несколько см, в то время, как линейный размер метафазных хромосом -несколько микрон; иными словами,ДНК в хромосоме упакована таким образом,что её линейные размеры сокращаются в Ю4 раз /46/. Предполагается, что благодаря наличию ДНК-белковых взаимодействий, ДНК в хроматине принимает высококомпактную форму.Морфологические исследования показывают,что компактность ДНК меняется с течением клеточного цикла и связана с функцией хроматина.Ясно, что между структурой хромосомы и функционированием генетического аппарата безусловно имеется корреляция. Исследования на политенных хромосомах дрозофилы показали, что видимый в световом микроскопе структурный элемент хромосомы - диск, соответ - 12 ствует, по-видимому, одному структурно-функциональному генетическому элементу хромосомы /47/. Средняя длина ДНК, приходящаяся на такой элемент, составляет примерно 35000 пар оснований нуклеотидов (35 кб).
В работе /48/ была, предложена, модель дезоксинуклеопротеида (ДНП).В этой модели основные аминокислоты гистонов связаны с фосфатными группами ДНК,а неосновные аминокислоты выступают наружу, образуя петли,как изображено на рисЛ.Такое расположение гистонов вдоль двойной спирали ДНК способствует образованию структуры,которая под электронным микроскопом видна как нить . диаметром 40-50 А.Согласно предложенной модели,образование ни о
тей диаметром 100 А объясняется взаимодействием неосновных аминокислот в составе петель,в результате которого происходит о сворачивание нити хроматина в спираль с шагом 120 А (Рис.1).
За последние 10-15 лет возникло и укрепилось другое мнение об организации структуры хроматина. Наиболее важный результат, полученный за это время - обнаружение субъединиц хроматина ну-клеосом, т.е. глобулярных ДНП-частиц, регулярно повторяющихся вдоль нитей нуклеопротеида в препаратах хроматина.
Представления о нуклеосомах как о субъединицах хроматина впервые были сформулированы Корнбергом и др./49-51/. По мнению авторов этих работ, нуклеосома представляет собой квази-сферическую частицу диаметром 100 А, состоящую из отрезка ДНК длиной около 200 пар оснований и гистоновго ядра (гистоноокта-мера)содержащего по-две молекулы четырех типов гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4. В основу этой модели легли следующие данные:
Методика дифференциальной сканирующей микрокалориметрии
Сложность измерения малых тепловых эффектов, наблюдающих-ся в разбавленных растворах биополимеров при их прогреве, была преодолена применением дифференциального метода определения прироста теплоемкости. Хотя этот метод давно известен,лишь за последние 20 лет стало возможным так усовершенствовать конструкцию дифференциального микрокалориметра, что его чувствительность возросла на несколько порядков. Повышению чувствительности способствовало также применение новейшей электронной техники, позволившей полностью автоматизировать процесс прогрева эталона и образца.
Как известно, в дифференциальных калориметрах в отличие от абсолютных калориметров определяется разность теплоемкости между образцом и эталоном, а не её абсолютная величина.
Для оценки разности температурного интервала эталон и образец прогреваются одновременно, с одинаковой скоростью, в одинаковых условиях, поэтому дифференциальный микрокалориметр всегда состоит из двух идентичных ячеек, расположенных строго симметрично друг к другу, и условия их прогрева максимально одинаковы. Соблюсти такие строгие требования к идентичности ячеек практически невозможно, поэтому для определения прироста теплоемкости, сначала обе ячейки загружаются стандартным веществом, а затем в одну из ячеек помещают образец. Прирост теплоемкости при сканировании определяют двумя экспериментами, в первом из которых устанавливается т.н. «базисная линия" прибора. Чем больше чувствительность прибора, тем больше будет сказываться неидентичность теплоємкостей ячеек, и искажаться «базисная линия прибора. Поэтому при эксперименте подбираются такие образец и эталон, теплоемкости которых мало отличаются друг от друга. При исследовании растворов биополимеров в эталонную ячейку заливают растворитель, т.к. в этом случае различие в теплоємкостях обусловлено непосредственно растворенным веществом.
Принцип метода заключается в измерении разности температур между образцом и эталоном, при их непрерывном и равномерном прогреве. Регистрируемая при этом кривая характеризует зависимость теплоемкости образца-от температуры (если d/ї/бЛ =cotvs.). Экспериментальное решение этого вопроса возможно путем осуществления отрицательной обратной связи по тепловому балансу между образцом и эталоном. В настоящее время имеется два основных метода измерения разности теплоємкостей между образцом и эталоном. Первый состоит в измерении разности температур между ячейками образца и эталона, прогреваемых с одинаковой скоростью, второй - в измерении разности мощностей, необходимых для их нагрева с одинаковой скоростью, т.е. определяется мощность, которая компенсирует разность теплоємкостей образца и.эталона, при их равномерном прогреве /2, 5, 6, 30, 177, 178/.
В первом случае обратная связь осуществляется тепловым потоком через теплообменник (термобатарею), соединяющий ячейки. Если в одной из ячеек будет происходить эндо или экзо-термичес - 53 кий процесс, то между ячейками возникает разность температур, которая будет меняться пропорционально скорости процесса тепловыделения (поглощения). Тепловой поток через термобатарею будут компенсировать изменение (увеличение и последующее уменьшение) скорости процесса тепловыделения (поглощения), в результате чего между ячейками установится новая постоянная разность температур, если процесс сопровождается скачком теплоемкости. Если же такого скачка теплоемкости нет, то установившаяся разность температур будет такой же, как при начале процесса. Как было показано /196/, измеряемая разность температур (лТ) пропорциональна изменению теплоемкости (С), T = Wc(T)..(I) В формуле (I) величина теплового потока W определяет скорость и знак изменения температуры. .
Тепловые свойс тва растворов хроматина
На рис.20 приведена запись теплопоглощения, наблюдаемая при прогреве раствора хроматина, выделенного из ядер печени мышей линии СЗНА. Процесс денатурации протекает двухстадийно,. охватывая температурный интервал 66-92С, с максимумами тепло А л О поглощения TJL - 75,8 С, Т. = 82,6 С, с ширинами интервала денатурации на полувысоте пиков теплопоглощения д. - 4,5С и дТ? = 4,5С и тепло тами денатурации Q = 3,7 кал/г ДЕК и Q] = = 9,4 кал/г ДНК. - ."
Теплота денатурации, равная 3,7 кал/г ДНК на первой стадии теплопоглощения оказалась значительно большей, чем предполагалось согласно представлениям, развитым в работе /166/ на основе спектрофотометрических исследований. По мнению этих авторов, слабое увеличение оптической плотности растворов хроматина в области температур 68-78С (в нашем случае 58-72С) связано с денатурацией свободных участков ДНК в хроматине, а более значительное увеличение оптической плотности при более вы- соких температурах (80-90С) - с денатурацией ДНК гистонового комплекса.
Согласно литературным данным /47/ (см.также обзорную часть диссертации),свободная ДНК в хроматине составляет не более 5-10$ от общей длины ДНК,в хроматине,т.е.Q (предполагаемое) должно быть не более 1,3 кал/г.Приведенные же выше значения на первой стадии составляют не менее 28$ от интегральной теплоты денатурации.Это несоответствие непосредственно указывает на то,что первая стадия теплового перехода не может быть -связана только с денатурацией свободной ЦЛСБыло также показано,что добавление ионов Mg++ в раствор нефрагментированного хроматина смещает основной высокотемпературный пик вверх по температурной шкале на 2С,а максимум слабого-низкотемпературного пика теплопоглощения-вниз по температурной шкале на 3С.Такое влияние ионов Big" на процесс денатурации хроматина непосредственно указывает на то,что первая стадия теплопоглощения не может быть связана с денатурацией межнуклеосомной-свободной ДНК в хроматине,так как в этом случае увеличение концентрации ионов Mg++ в растворе неизбежно должно было привести к увеличению Т Ц). Кроме того,величина теплопоглощения на основной (П) стадии для различных хроматинов и при различных ионных силах раствора,не приводящих к потере гистона HI и к изменению соотношения ДЩ-белок,составляет 11,0+1,5 кал/г ДНК. Эта величина с хорошей точностью совпадает с теплотой денатурации ДНК в разбавленных растворах с учетом зависимости АНДД =(Т), обнаруженной в работах /I, II, 175/.
Приведенные выше экспериментальные факты дали нам возможность ло-другому объяснить процесс денатурации хроматина.
Было предположено, что на первой стадии происходит раекру - 80 о чивание суперспирали диаметром 100 А (согласно современным представлениям нуклеосомного уровня организации /47/), а на второй - плавление двойной спирали ДНК.
В дальнейшем схожие объяснения процесса денатурации нуклеосомного кора с некоторыми уточнениями были предложены в работах /168, 170/ на основе применения новейшей экспериментальной техники и методик выделения хроматина и нуклеосомного кора.
В частности,в работе Фулмера и Фасмана /168/ было показано (см.гл.1, п.1.5, рис.9),что при молярностях раствора выше 3-4мМ фосфата натрия (эти ионные силы совпадают с ионными силами, используемыми нами) на кривых тепловой денатурации цельного хроматина не наблюдается заметной индивидуальной стадии денатурации свободной-межнуклеосомной ДНК.Межнуклеосомная ДНК денатурирует одновременно с ДНК нуклеосомного кора и только её малая незначительная часть денатурирует при более низких температурах 60--70С.
class4 КАЛОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЛОЖНЫХ БИОЛОГИ
ЧЕСКИХ СИСТЕМ class4
Тепловые свойства хроматина в составе клеточных ядер
Знание физико-химических характеристик индивидуальных макромолекул в растворе не всегда достаточно для понимания их функции, так как большинство из них in vi-VO функционируют в виде сложных упорядоченных надмолекулярных образований. Однако изучение тепловых свойств высокоупорядоченных структур ограничено, в том числе имеется мало данных по тепловым свойствам нуклео-протеидных комплексов. Это связано с двумя обстоятельствами: а) в связи с чрезвычайно сложной упаковкой и гигантскими размерами ДНК крайне трудно выделить хроматин без каких-либо повреждений. Было показано, что даже незначительное фрагментирование вызывает изменение в активности матрицы, в перераспределении гистонов и изменение информации хроматина; б) отсутствие высокочувствительных сканирующих микрокалориметров, предназначенных для исследования сложных биологических систем.
В настоящей главе сделана попытка охарактеризовать процессы плавления нативного хроматина, входящего в состав изолированных клеточных ядер, и клеток высших эукариот.
