Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
1. Структура гиппокампа 9
1.1. Морфология гиппокампа 9
1.2. Характеристика основных внутренних связей гиппокампа 12
1.2.1. Связь между гранулярными клетками DG и поля САЗ/СА4.. 12
1.2.2. Аксоны пирамидных нейронов полей С А2, С АЗ/С А4 15
1.2.3. Проекции нейронов в хилусе 16
1.2.4. Связи полиморфных клеток 11
1.2.5. Афферентные пути 18
1.2.5.1. Проекции от ЭК 18
1.2.6. Эфферентные пути 19
2. Современные методы анализа дендритных шипиков 20
2.1. Световая микроскопия , 20
2.2. Электронная микроскопия 20
2.3. Конфокальная микроскопия и молекулярно-биологические методы 21
2.4. Трехмерная реконструкция и стереологический анализ 22
3. Пространственное обучение 23
3.1. Синаптическая пластичность гиппокампа и память 23
3.2. Пространственное обучение в водном лабиринте Морриса 25
3.3. Области мозга принимающие участие в обучении в водном лабиринте Морриса 26
3.3.1. Участие различных областей мозга в пространственном ориентировании 27
3.3.2. Участие гиппокампа в пространственном ориентировании 28
3.4. Гиппокампо-связаниое обучение 29
3.5. Долговременная потенциация гиппокампа и пространственное обучение в водном лабиринте Морриса 31
4. Стресс и его воздействие на гиппокамп 33
4.1. Стресс и синаптическая пластичность гиппокампа 33
4.2. Влияние стресса на морфологию дендритов гиппокампа 35
Экспериментальная часть
Глава II. Материалы и методы исследования 37
1. Подготовка животных, экспериментальные модели 37
2. Приготовление образцов для световой и электронной микроскопии 40
3. Метод получения серийных ультратонких срезов 42
4. Электронная микроскопия 43
5. Трехмерная реконструкция 44
6. Анализируемые параметры 45
7. Методы статистической обработки количественных данных 45
8. Измерение объема гиппокампа, поля САЗ и зубчатой фасции . 46
Глава III. Результаты 48
1. Анализ обучения животных двух экспериментальных групп 48
2. Влияние хронического иммобилизационного стресса и обучения в водном лабиринте на средний объем гиппокампа, поля САЗ и зубчатой фасции 49
3. Ультраструктура и трехмерная организация «колючих шишек» пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа 50
4. Влияние хронического иммобилизационного стресса и обучения в водном лабиринте на трехмерную организацию «колючих шишек» пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа крыс 53
4.1. Изменение трехмерной организации «колючих шишек» 53
4.2. Количественный анализ «колючек» в «колючей шишке» 56
4.3. Количественный анализ постсипаптических уплотнений 58
4.4. Количественный анализ мультивезикулярных телец 61
Глава IV. Обсуждение 62
Выводы 68
Список цитируемой литературы
- Характеристика основных внутренних связей гиппокампа
- Приготовление образцов для световой и электронной микроскопии
- Влияние хронического иммобилизационного стресса и обучения в водном лабиринте на средний объем гиппокампа, поля САЗ и зубчатой фасции
- Количественный анализ «колючек» в «колючей шишке»
Введение к работе
В настоящее время процессы обучения и формирования памяти связывают с пластичностью контактов между нейронами, в том числе со структурными изменениями синапсов. Согласно Бэйли и Кэнделу пластичность синапсов может быть разделена на 2 категории: 1) изменение уже существующих синапсов; и 2) изменение межнейронных связей за счет образования новых синапсов или утраты существующих (Bailey and Kandei 1993, Bailey et al., 2000). Считается, что синаптическая пластичность связана с пластичностью дендритных шипиков, поскольку до 90% всех возбуждающих аксо-дендритных синапсов гиппокампа располагается на дендритных шипиках.
Ключевая роль гиппокампа в обеспечении таких функций мозга, как обучение и память (Виноградова, 1975; Vinogradova, 2001; Squire, 1992; Eichenbaum, 2001) находит отражение в значительных структурных изменениях сипаптических контактов в гиппокампе, в том числе дендритных шипиков пирамидных нейронов поля САЗ при пространственном обучении (Jung et al., 1994; Moser et al., 1993; 1995; Ramirez-Amaya et al., 1999; 2001) и воздействии стресса (McEwen, 1999). В поле САЗ гиппокампа локализуются гигантские синапсы, образованные между гигантскими расширениями (varicosity) на мшистых волокнах и «колючими шишками». Мшистые волокна являются немиелинизированными аксонами гранулярных клеток зубчатой фасции. «Колючие шишки» (thorny excrescence), представляют собой специализированные выросты мембраны апикальных деидритов пирамидных нейронов поля САЗ в их проксимальной области. Впервые они были описаны Рамон-и-Кахалом в начале прошлого века (Ramon у Cajal, 1911).
Широко обсуждается функциональная значимость изменений формы и размеров шипиков (Marrone and Petit, 2002; Hayashi and Majewska, 2005), величины и структуры постсинаптических уплотнений (Geinisman et al., 1992; Rusakov et al., 1997; Eyre et al., 2003). Противоречивость результатов, получаемых при изучении структурной пластичности сипаптических контактов с использованием разнообразных моделей изменения функционального состояния тех или иных структур мозга, определяется, по всей видимости, не полной адекватностью используемых методов морфологического анализа. В ЦНС размеры дендритных шипиков подавляющего большинства синапсов слишком малы для точной оценки их количественных параметров свето-микроскопическими методами, включая конфокальную лазерную сканирующую микроскопию. Вместе с тем, результаты количественного анализа и реконструирования различных субклеточных структур на основе одиночных ультратонких срезов дают слишком большую ошибку (Coggeshall and Lekan, 1996). В последнее время появляется все больше работ по трехмерной (3D-three-dimensional) реконструкции и стереологическому анализу типичных дендритных шипиков, других компонентов синапсов, субклеточных структур.
В случае гигантских синапсов поля САЗ гиппокампа достоверные данные об их размерах и структуре можно получить, только применяя методы реконструкции. С появлением современных компьютеров и специального программного обеспечения, а также с развитием технологии изготовления серийных ультратонких срезов, стало возможным получить точные количественные характеристики и таких сложных структур, как «колючие шишки». Это позволяет сопоставить направленность пластических структурных изменений типичных и гигантских синаптических контактов, обусловленных изменениями функциональной активности.
Целью настоящей работы явилось исследование влияния пространственного обучения и воздействия им мобилизационного стресса на трехмерную организацию «колючих шишек» поля САЗ гиппокампа крыс.
Исходя из цели работы были поставлены следующие задачи:
1, С помощью метода трехмерной реконструкции на основе серийных ультратонких срезов провести качественный сравнительный анализ «колючих шишек» поля САЗ гиппокампа крыс при различных функциональных состояниях мозга у животных следующих групп: контрольной, после иммобилизационного стресса, после обучения в водном лабиринте Морриса и группы после иммобилизационного стресса с последующим обучением в водном лабиринте,
2. Провести анализ изменения количества «колючек» на «колючих шишках», объема и площади поверхности «колючих шишек» пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа контрольной и экспериментальных групп животных.
Провести анализ изменения количества постсинаптических уплотнений (ПСУ), их площади поверхности и пропорции пятнистые/перфорированные ПСУ в «колючих шишках» пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа контрольной и экспериментальных групп животных.
Провести количественный анализ мультивезикулярных телец в «колючих шишках» пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа контрольной и экспериментальных групп животных.
В ходе настоящей работы была продемонстрирована структурная лабильность «колючих шишек» поля САЗ гиппокампа. В результате обучения отмечено увеличение объема «колючих шишек», числа колючек в них, количества и площади и доли перфорированных постсинаптических уплотнений, а также увеличение количества мультивезикулярных телец. После длительного иммобилизационного стресса происходит ретракция «колючих шишек» с уменьшением их объема и количества мультивезикулярных телец,но при этом не происходит уменьшения площади постсинаптических уплотнений. Обучение после стресса приводит к более быстрому восстановлению объема «колючих шишек» и дополнительному увеличению площади постсинаптических уплотнений. Количество мультивезикулярных тел в «колючих шишках» уменьшается после стресса и увеличивается после обучения. Полученные данные расширяют представления о нейроанатомических основах пластичности синапсов, что может быть актуально при изучении свойств пластичности центральной нервной системы.
Характеристика основных внутренних связей гиппокампа
Тонкие немиелинизированные главные стволы аксонов гранулярных клеток -мшистые волокна (MB) - собираются в хилусе и следуют двумя плотными пучками (супра- и инфрапирамидным) вдоль пирамидного слоя поля САЗ/СА4 вплоть до поля СА2. Инфрапирамидный пучок менее мощный и существует не на всех уровнях гиппокампа относительно его продольной оси, а преимущественно в септальной и в меньшей степени в средней его частях. По мере приближения к темпоральному полюсу этот пучок постепенно сокращается по длине и совсем исчезает. Волокна обоих пучков по ходу следования через каждые 100-200 мкм образуют гигантские синаптические бутоны, оканчивающиеся на «колючих шишках» дендритов пирамидных нейронов. Основная область окончаний MB — слой люцидум, граничащий с пирамидным слоем (Claiborne et al, 1986; Gaarskjaer, 1986; Lorente de No, 1934; Tombol et al., 1978). Часть MB, однако, оканчивается на сомах, базальных дендритах (Gaarskjaer, 1986) и даже на начальных сегментах аксонов пирамидных клеток (Ibata et al., 1982). Синаптические бутоны MB достигают огромной величины (до 10 мкм), заполнены пресинаптическими везикулами, содержат до 6 митохондрий и имеют, как правило, несколько зон асимметричных синаптических контактов. Имеются также симметричные контакты, назначение которых неизвестно (Журавлева, 1976; Tombol et al., 1978). Один синаптический бутон может контактировать с шипиками сразу нескольких (до 5) пирамидных клеток (Chicurel and Harris, 1992; Rolls, 1988). Уникальное строение гигантских синапсов MB указывает на их особые функциональные возможности, которые до сих пор остаются не вполне ясными. Помимо гигантских шипиковых терминален, общее число которых у крыс и мышей составляет 10-15 бутонов на волокно, MB образуют также многочисленные мелкие (0,5-2 мкм) варикозные расширения, осуществляющие синаптические контакты с дендритами пирамидных клеток по ходу следования (en passant) (Claiborne et al., 1986; Peters and Kaiserman-Abramof, 1970; Tombol et al., 1978). В результате этого гранулярные клетки каждого локуса DG оказываются связанными практически со всеми пирамидными нейронами САЗ/СА4, лежащими, по пути следования данной группы MB. Такой принцип связи между гранулярными и пирамидными клетками выявляется и в электрофизиологических исследованиях (Bragin et al., 1977; Buzsaki, 1986). Помимо пирамидных нейронов синапсы MB обнаружены и на различного типа полиморфных клетках, в том числе на корзинчатых нейронах поля САЗ/СА4 (Frotscher, 1989).
В поле САЗ/СА4 основные аксонные стволы гранулярных клеток отдают 5-12 первичных коллатералей, которые в свою очередь делятся на вторичные и третичные, образуя густую сеть, пронизывающую все это поле. Часть коллатеральных ветвлений MB достигает гранулярного и молекулярного слоев DG (Gaarskjaer, 1986). В хилусе коллатеральные ветвления аксона одной гранулярной клетки занимают область протяженностью до 400 мкм по продольной оси DG (Claiborne et al, 1986). Каждая веточка этой коллатеральной сети образует 1-2 крупных (диаметром 2-4 мкм) синапса на шипиковых выростах мшистых нейронов и множество мелких (-150 на одно MB) варикозных синаптических контактов на различного типа полиморфных клетках (Claiborne et al, 1986; Ribak et al, 1985). Идентифицированы терминали MB на канделябрах, корзинчатых и на веретенообразных клетках хилуса (Deller and Leranth, 1990; Ribak and Seress, 1983, 1988; Soriano etal., 1990).
Связь DG-CA3/CA4 осуществляется по сегментарному принципу в направлении примерно перпендикулярном продольной оси гиппокампа. Данные о поперечном направлении следования MB подтверждены электрофизиологически (Andersen et al., 1971; Bragin et al., 1977). В этих же работах показано, что в пределах данного сегмента к каждому л о кусу поля САЗ/СА4 идут связи от любого локуса DG. Последний факт подтверждается также расчетами, сделанными на основе морфологических данных. Если диаметр пирамидных нейронов САЗ/СА4 -20 мкм, а расстояние между гигантскими синапсами одного MB составляет -130 мм (величина моды распределения), то, следовательно, каждая гранулярная клетка может контактировать посредством гигантских синапсов с каждой 6-7-й пирамидой (Claiborne et al, 1986), В таком случае каждый локус DG, содержащий 6—7 гранулярных клеток, может контактировать с каждой пирамидой поля САЗ/СА4 посредством мощных гигантских синапсов с вероятностью 1,0. Если же учитывать многочисленные варикозные синапсы MB, то вероятность связи DG - САЗ/СА4 еще более увеличивается.
Предполагается (Отмахов, 1993; Buzsaki, 1986), что на любом уровне гиппокампа по его продольной оси связь между гранулярными клетками и нейронами поля САЗ/СА4 осуществляется по сегментарному принципу, а внутри каждого сегмента — по принципу «каждый на всех».
Основным медиатором MB является глутамат, действующий в основном через два типа рецепторов: каинатный и квисквилатный (Andreasen et al., 1988; Sawada and Yamamoto, 1985). 1-метшьО-аспартатный (NMDA) тип рецепторов в MB отсутствует (Andreasen et al., 1988). Кроме этого, в MB содержится опиоидный пептид динорфин, высвобождающийся вместе с глутаматом при активации гигантских синапсов (Stengaard-Pedersen et al., 1983; Terrian et al,, 1988). Существуют данные, позволяющие предполагать способность MB выделять не только глутамат, но и ГАМК (Walker et al., 2001). У некоторых животных (морские свинки, мыши, ежи, но не крысы) в MB выявляется также холецистокинин (Gall et al, 1986; Stengaard-Pedersen et al., 1983). В гигантских мшистых синапсах обнаруживается очень высокая концентрация цинка, который участвует в регуляции синаптической передачи (Perez-CIausell and Danscher, 1985; Terrian et al., 1988).
Приготовление образцов для световой и электронной микроскопии
Для приготовления серий ультратонких срезов использовался ультрамикротом "Ultracut Е" Reihert-Jung (Австрия), алмазный нож Diatome и стеклянные ножи, изготовленные на станке для изготовления стеклянных ножей "Knife Maker" Reihert-Jung (Австрия). Для получения серий с ігужного участка сначала срезали несколько полутонких срезов толщиной 1-2 цт, которые затем окрашивали метиленовым синим или толуидиновым синим. На этих срезах с помощью светового микроскопа определяли местоположение исследуемой области на блоке. Обычно исследовалась проксимальная область дендритов приблизительно 20 им от сом нейронов поля САЗ гиппокампа (Chicurel and Harris, 1992; Sandi et al., 2003; Stewart et al., 2005).
Затем на найденном участке, используя левый край стеклянного ножа как фрезу, затачивали призму высотой около 50 urn, которая на всем протяжении имела прямоугольное сечение: одна сторона такого прямоугольника была 20-30 um, а другая не менее 10Q цт. Ультратонкие срезы толщиной около 70 nm готовили на ультрамикротоме с помощью алмазного ножа Diatome, экспериментально подбирая оптимальную скорость резки, чтобы исключить вибрацию. При этом срезы в виде непрерывной ленты располагались на поверхности ванночки ножа, заполненной водой. При возникновении необходимости расправить срезы, снижали поверхностное натяжение воды путем добавления в ванночку 2-5% раствора этанола или метанола. Ленты срезов с помощью ресничек разбивали на фрагменты, которые вылавливали на бленды, покрытые пленкой из пиолоформа (Pioloform).
Подготовка пленок из пиолоформа.
Для приготовления пленок использовали 1-1.5% раствор пиолоформа в хлороформе. Тщательно очищенные предметные стекла опускали в раствор пиолоформа и аккуратно извлекали. После высыхания хлороформа на предметном стекле образовывалась пленка пиолоформа. Далее пленки снимали на поверхность дистиллированной воды, на пленки укладывали бленды.
Контрастирование.
Перед просмотром в электронном микроскопе срезы контрастировали насыщенным раствором уранилацетата на 70% спирте в течение 10-20 минут, трижды промывали в дистиллированной воде и высушивали. Затем дополнительно окрашивали в течение 10-20 минут в растворе цитрата свинца по Рейнольдсу (Гайер, 1974), трижды промывали в дистиллированной воде и высушивали.
Для приготовления раствора цитрата свинца 1.33 г РЬЫОз и 1.76 г безводного трёхзамещённого цитрата натрия смешивали с 30 мл НгО, затем к получившейся творожистой массе добавляли 8 мл 1М NaOH, после чего раствор доводили до общего объема 50 мл и интенсивно размешивали до полного просветления.
Для приготовления насыщенного раствора уранилацетата в 70 % раствор этилового спирта добавлялся в избытке уранилацетат. Исследование ультратонких серий в электронном микроскопе.
Исследование ультратонких срезов проводили на электронном микроскопе JEOL 1010 (Япония), Тестирование увеличения проводили с помощью специальной реплики 2160 линий/мм. Для реконструкции произвольно выбирали сегменты дендритов в слое stratum lucidum, примерно в 10-20 urn от сомы клетки. Местонахождение типичных «колючих шишек» определяли согласно работе Gonzales с соавторами (2001), Для каждой серии были сфотографированы идентичные участки 100-160 последовательных срезов при увеличении 6000. Ориентирами для определения идентичных участков на последовательных срезах служили поперечно разрезанные миелинизированные аксоны, митохондрии и дендрити. Толщина срезов определялась по методу Fiala and Harris (2001). Ввод в компьютер и выравнивание изображений.
Серии негативов сканировали просвечивающим сканером HP ScanJet 7400С с разрешением 1200 dpi и сохраняли в формате JPEG, затем настраивали с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop 6.0. Для компенсации деформаций ткани в процессах резки, контрастирования и просмотра на электронном микроскопе осуществляли выравнивание (выстраивание) изображений. Для выравнивания изображений использовали специальное программное обеспечение SEM Align 1.26b, разработанное Dr. John Fiala (Бостонский университет, США) (http://www. synapses .bu.edu/).
Трёхмерные реконструкции.
Для осуществления трёхмерной реконструкции использовали специальное программное обеспечение IGL Trace 1.26b, разработанное Dr. John Fiala, и предварительно выровненные серии изображений срезов. Для создания трехмерных реконструкций в программе на каждом срезе вручную рисовали контуры сегмента дендрита с колючими шишками, аксонами, гладким и шероховатым ретикулумом, аппаратом Гольджи, постсинаптическими уплотнениями и митохондриями. Трехмерные реконструкции и количественные данные (объем, площадь поверхности и количество реконструированных структур) получали на основании контуров при помощи этой же программы.
Влияние хронического иммобилизационного стресса и обучения в водном лабиринте на средний объем гиппокампа, поля САЗ и зубчатой фасции
Слой stratum lucidum поля САЗ гиппокампа всех животных характеризуется наличием гигантских пресинаптических бутонов аксонов (или мшистых волокон) гранулярных клеток (Sousa et al., 2000), образующих синаптические контакты с «колючими шишками» в проксимальной области апикальных дендритов пирамидных нейронов.
Какова ультраструктурная организация «колючих шишек» дендритов нейронов поля САЗ? На Рис. 6 (А-Г) показаны «колючие шишки» (ТЕ), на которых располагаются «колючки» (Т от thorn). На «колючках» локализован асимметричный синаптический контакт с бутонами мшистых волокон. Расстояние от основания «колючей шишки» на дендрите до постсинаптического уплотнения в среднем составляет 2,9 рт и достигает 6,5 um (Chicurel and Harris, 1992). У обычных шипиковых синапсов это расстояние существенно меньше. Так в поле СА1 гиппокампа оно составляет 0,83 pm (Harris and Stevens, 1989), в мозжечке -1,19 рт (Harris and Stevens, 1988), в зрительной коре - 1,46 pm (Spacek and Hartmann, 1983).
При выполнении реконструкции сегмента дендрита с «колючей шишкой» на серии ультратонких срезов (см. Рис. 6 (А-Г)) была получена структура показанная на Рис. 7.
Внутри «колючих шишек» присутствуют (см. Рис. 6 Д-Е) цистерны гладкого и шероховатого ретикулума, свободные полирибосомы, митохондрии и микротрубочки. Также в «колючих шишках» находятся мул ьти везикулярные тельца, или эндосомы (Соопеу et al., 2002). Свободные полирибосомы встречаются в 95% «колючих шишек» (Chicurel and Harris, 1992), что говорит о наличии активного локального синтеза белка. В других типах шипиков полирибосомы встречаются гораздо реже: в мозжечке - в 13% шипиков (Spacek, 1985); в зубчатой фасции - в 20% шипиков (Steward, 1983); в зрительной коре - в 82% шипиков (Spacek, 1985). Свободные полирибосомы обеспечивают синтез, главным образом, цитозоль-растворимых и цитоскелетных белков, тогда как для синтеза
Четыре последовательных среза (серия из 150 срезов) слоя stratum lucidum поля САЗ гиппокампа контрольного животного. MFB - бутоны мшистых волокон, D - дендрит, Т1-ТЗ - три «колючки», ТЕ - «колючая шишка». Шкала = 1цт. Черные стрелки показывают основания ТЕ. Д-Е. Более высокое увеличение Рис. ЗБ-В, показаны детали двух «колючек». rER - шероховатый эндоплазматический ретикулум, ER - гладкий эндоплазматический ретикулум, MVB - мультивезикулярные тельца (эндосомы), PR - полирибосомы, mt - микротрубочки, МТ -митохондрия, GB - гигантский бутон, AST - астроцит. Прозрачные стрелки на Рис. ЗД-Е показьшают слияние эндосом с постсинаптической мембраной «колючей шишки» через цистерны гладкого эндоплазматического ретикулума. Шкала = 0.5um. Рис. 7. А. Трехмерная организация «колючей шишки» контрольной крысы. Б. это же, показана внутренняя часть. интегральных белков необходим шероховатый ретикулум, а для их созревания требуется присутствие аппарата Гольджи.
Митохондрии и микротрубочки отсутствуют во всех категориях обычных дендритных шипиков (грибовидные, тонкие, пеньковые и разветвленные). Тубулиновые микротрубочки, согласно данным Chicurel и Harris (1992), обычно находят в «колючих шишках» с числом «колючек» больше четырех. Это, возможно, связано с тем, что «колючие шишки» большого размера и с большим числом ветвлений имеют более сложное строение цитоскелетного каркаса, необходимое для сохранения их формы и нормального функционирования клеточного транспорта (Black and Baas, 1989).
Присутствие митохондрий, полирибосом и микротрубочек в «колючих шишках» создает условия для локального синтеза и транспорта белка, что компенсирует относительную удаленность от источника белкового синтеза, находящегося в дендрите.
Мультивезикулярные тельца, или эндосомы (Cooney et al., 2002) образуются в диктиосомах как в соме нейронов, так и в дендроплазме, мигрируя в шипики (грибовидные, «колючие шишки») (Chicurel and Harris, 1992). Часто мультивезикулярные тельца бывают связаны с цистернами гладкого эндоплазм этического ретикулума (см. Рис. 6 (Д-Е)). Имеются данные, что мультивезикулярные тельца являются поставщиками субъединиц новых рецепторов и каналов (Bailey et al., 1992; Cooney et al., 2002). Их количество возрастает в процессе синаптогенеза и, предполагается, что они участвуют в формировании новых синапсов (McWilliams and Lynch, 1981).
Таким образом, «колючие шишки» представляют собой сложные выросты мембраны дендритов, похожие на короткие дендритные веточки. Они состоят из тонкого ствола, на котором располагаются «thorns» («колючки») - маленькие выросты, являющиеся аналогом обычных шипиков.
4. Влияние хронического иммобилизационного стресса и обучения в водном лабиринте на трехмерную организацию «колючих шишек» пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа крыс. 4.1. Изменение трехмерной организации «колючих шишек».
Чтобы выяснить, какие изменения происходят в организации «колючих шишек» после воздействия иммобилизиационного стресса и пространственного обучения было реконструировано более 40 дендритных сегментов на каждую экспериментальных группу животных.
Типичные трехмерные реконструкции дендритных сегментов слоя stratum lucidum поля САЗ гиппокампа крыс контрольной и трех экспериментальных групп. А. Контроль. Б. Обучение в водном лабиринте. В. Стресс. Г. Стресс + обучение в водном лабиринте.
Трехмерные реконструкции «колючих шишек» поля САЗ гиппокампа контрольной крысы (А), после чения в водном лабиринте (Б), после стресса (В) и после стресса + обучения в водном лабиринте (Г). Шкала = 1 цт. На Рис. 8А-Г представлены примеры трехмерной реконструкции типичных проксимальных апикальных дендритных сегментов из слоя stratum lucidum для всех экспериментальных групп. По внешнему виду дендритные сегменты каждой из трех экспериментальных групп имеют отличительные особенности по сравнению с контрольной группой (Рис. 8А). На Рис.8Б показана реконструкция сегмента дендрита пирамидного нейрона поля СЛЗ крысы после обучения, дендритный ствол выглядит крупнее с большим количеством «колючек» по сравнению с контролем. После стресса количество «колючек» заметно меньше, чем в контроле (см. Рис. 8В). После стресса и обучения значительных различий по сравнению с контролем не наблюдается (см. Рис. 8Г). Как показано в Таблице 2 объёмы нервной ткани в полях СЛЗ гиппокампа животных после стресса и после обучения практически не отличаются от контрольной группы животных.
При анализе большого числа отдельно взятых трехмерных реконструкций «колючих шишек» результаты полученные при качественном анализе дендритных сегментов полностью подтверждаются. На Рис. 9А-Г показаны примеры трехмерной реконструкции типичных «колючих шишек» из контрольной и экспериментальных групп. Видно увеличение размеров «колючих шишек» у животных после обучения в водном лабиринте (Рис. 9Б) по сравнению с контрольными животными (Рис. 9А). После стресса размеры «колючих шишек» уменьшаются (Рис. 9В). При обучении крыс после стресса (Рис. 9Г) наблюдается восстановление размеров «колючих шишек». Важной ультраструктурной особенностью «колючих шишек» животных после пространственного обучения (Рис. 9Б) является появление многочисленных спинулоподобных и/или похожих филоподии структур на «колючках». Именно эти структуры обеспечивают рост «колючих шишек» и увеличение размеров после обучения.
Количественный анализ «колючек» в «колючей шишке»
В настоящей работе впервые на электронно-микроскопическом уровне проведено количественное исследование изменений организации «колючих шишею) на дендритах нейронов поля САЗ в различных поведенческих моделях с использованием трехмерных реконструкций на основе серийных ультратонких срезов. Одновременно с организацией «колючих шишек» также исследованы синапсы, а именно, постсинаптические уплотнения в области контакта «колючих шишек» с пресинаптическими бутонами мшистых волокон, образованными аксонами гранулярных клеток зубчатой фасции. Наши данные демонстрируют относительно быстрые пластические изменения «колючих шишек» (по крайней мере, часы) при различных функциональных состояниях мозга: контроль, иммобилизационный стресс, обучение в водном лабиринте и стресс с последующим обучением в водном лабиринте.
Наши данные показывают, что хронический иммобилизационный стресс и пространственное обучение в водном лабиринте оказывают противоположное действие на морфологическую структуру «колючих шишек» поля САЗ гиппокампа. Стресс вызывает ретракцию (втягивание) «колючих шишек», при этом уменьшается их объем, но не количество «колючек» в «колючей шишке». Секреция кортикостероидных гормонов при стрессор ном воздействии, вызывает многие патологические эффекты, возникающие при длительном стрессе, ишемии или старении (Sapolsky, 1990; Sapolsky, 1992; Sapolsky et al., 1986). Свое деструктивное действие кортикостероидные гормоны осуществляют в основном через глкжокортикоидные рецепторы (Sapolsky, 1992). Кортикостероидные гормоны вызывают гибель пирамидальных клеток гиппокампа, вызывают целый каскад событий приводящих к физиологическому дисбалансу и дальнейшей гибели клеток. Такой эффект кортикостероидных гормонов наблюдается в СА1 и САЗ области гиппокампа. (Sapolsky, 1992; Wooley et al., 1990). Кроме того, именно апикальные, а не базальные, дендриты пирамидных нейронов поля САЗ особо восприимчивы к воздействию длительного стресса (Watanabe et al., 1992, McEwen, 1999). Уменьшение длины и сложности апикальных, но не базальных, дендритов пирамидных нейронов поля САЗ было обнаружено импрегнацией нейронов по методу Гольджи после хронического повышения уровня концентрации глюкокортикоида (Wooley et al., 1990) и воздействия различных видов хронического стресса (Watanabe et al., 1992; Magarinos и McEwen, 1995; Magarinos et al., 1996). Представленные в данной работе результаты убедительно свидетельствуют об изменении трехмерной структуры синапсов в проксимальной области апикальных дендритов пирамидных нейронов поля САЗ в результате воздействия хронического иммобилизационного стресса. Ранее было показано, что после 21-28 дней стресса происходят значительные изменения в слое stratum lucidum поля САЗ. В бутонах мшистых волокон (или пресинаптической части) наблюдается перегруппировка расположения синаптических везикул и увеличение площади поверхности профилей митохондрий (Magarinos et al., 1997). На 31% уменьшается количество синапсов и на 32% площадь поверхности постсинаптических уплотнений (Sousa et al., 2000; Sandi et al., 2003). Кроме того, изменениям структурным сопутствовали изменения функции гиппокампа: хронический стресс приводил к подавлению возникновения долговременной потенциации ДП {longerm potentiation) на комиссуралыю-ассоциативном входе поля САЗ (Pavlides et al., 2002) и к ослаблению способности выполнения задач пространственного обучения (Luine et а!., 1994; Conrad et al., 1996; Venero et al., 2002; Sandi et al., 2003). Наблюдаемое недостоверное ослабление выполнения задач пространственного обучения в группе «стресс + пространственное обучение» можно объяснить процессами адаптации, возникающими при длительном стрессе. В адаптации организма к изменившимся условиям внешней среды важную роль играют кортикостероидные гормоны. С их участием регулируется функция гипофизарно-адренокортикальной системы механизмами обратной связи, при этом ингибируется гормональный ответ при стрессе (Шаляпина, Ордян, 2000).
В результате обучения животных в водном лабиринте происходит достоверное увеличение объема «колючих шишек», количества «колючек» в «колючей шишке» и доли перфорированных ПСУ по сравнению с контрольными животными (Таблица 3, 4). Пространственное обучение ведет к образованию новых «колючек» (дендритных шипиков) на «колючей шишке», что прямо коррелирует с фактом появления спину л-подобных структур на поверхности «колючек» (Рис. 9Б). Для дендритных шипиков поля СА1 и зубчатой фасции гиппокампа спинулы играют важную роль в обмене метаболитами не только между пресинаптическим бутоном и дендритным шипиком, как это ранее считалось, но и между дендритами, между дендритами и глиальными клетками, между аксонами и глиальными клетками (Spacek and Harris, 2004). В этой связи, наблюдаемые нами после пространственного обучения спинул-подобные структуры в слое stratum lucidum поля САЗ, образуемые при росте новых «колючек», скорее представляют собой филоподии, а не спинулы (Fiala et al., 1998). Важно, что наблюдаемые изменения в организации «колючих шишек» и ПСУ наблюдаются в течение относительно короткого времени - после двух сессий пространственного обучения крыс.
Полученные нами данные согласуются с результатами работы Popov et al (1992). В этой работе, используя методику окраски нейронов по Гольджи, была показана быстрая обратимость, в течение 2 часов, ретракции «колючих шишек» поля САЗ гиппокампа сусликов после выхода из состояния гибернации. Наши данные также согласуются с результатами работы Sandi et al. (2003), в которой обучение в водном лабиринте, состоящее также из двух сессий, восстанавливало редуцированную после стресса плотность ПСУ «колючих шишек». Обратимость значительного влияния стресса на структуру «колючих шишек» была предположена ранее: во-первых, Sousa et al. (2000), используя двумерную морфометрию, показали сокращение количества синапсов мшистых волокон в поле САЗ после 28-дневного воздействия случайного сочетания разных видов стресса, количество синапсов восстанавливалось только через месяц. Во-вторых, поведенческие и светомикроскопические исследования показали, что после прекращения воздействия 21-дневного иммобилизационного стресса требуется 10-17 дней для восстановления ослабленной способности к обучению (Luine et al., 1994) и атрофии дендритов (Conrad et al., 1999).
