УФ-чувствительность молекул гемоглобина с различным субъединичным составом Козлова, Ирина Евгеньевна

Введение к работе

Актуальность проблемы. В настоящее время резко возрос интерес исследователей к изучению структурно-функциональных свойств транспортных белков крови и особенно гемоглобина. Это связано, в первую очередь, с возможными нарушениями процессов транспорта при различных патологиях и с попытками создания эффективных кровезаменителей, что обусловлено ограниченным сроком хранения донорской крови и необходимостью очень больших ее количеств в чрезвычайных обстоятельствах.

Гемоглобин как объект исследования имеет ряд преимуществ. Он является удобной моделью для изучения влияния различных агентов на белки, в частности на ферменты, поскольку простетическую группу данного гемопротеида - гем - можно рассматривать как аналог активного центра молекул фермента. Кроме того, полностью идентифицирована первичная структура гемоглобина, взаимное расположение атомов в его молекуле. Перечисленные факты в совокупности с легкостью получения предопределяют неослабевающий интерес исследователей к гемоглобину.

Метод регистрации кривых диссоциации оксигемоглобина нашел широкое применение для анализа функциональных свойств этого олиго-мерного белка в научных исследованиях и в медицинской практике. Кривая диссоциации оксигемоглобина (КДО) является важнейшим показателем кислородсвязывающей способности данного белка, поскольку позволяет определить сродство гемоглобина к кислороду, его структурное состояние в норме и в условиях патологии, при воздействии различных физико-химических факторов на гембелок.

В процессе функционирования оргашізма в эритроцитах постоянно образуется окисленное производное гемоглобина - метгемоглобин, который восстанавливается в дезоксигемоглобин ферментной системой метге-моглобинредуктазой. Однако при различных патологических состояниях организма, при действии некоторых внешних агентов содержание метге-моглобина в крови резко возрастает (И.С. Станкова, Г.В. Максимов, О.Р. Колье, 1996).

Тот факт, что тетрамеры гемоглобина способны к обратимой диссоциации, в первую очередь на димеры типа ар, позволяет предположить, что существует вероятность реассоциащш димеров с различным состоянием атомов железа в составе порфирина. Возможность формирования функционально активных гибридных молекул гемоглобина была экспериментально подтверждена в ряде иселедоваїшй (Д.М. Рифкинд, 1978; Z. Szweda-Lewandowska, М. Puchala, М.А. Kowalska, 1981). В связи с этим значительный теоретический и практический интерес представляет изу-

чсние влияния физико-химических факторов на функциональные свойства образцов гемоглобина, содержащих гибриды валентности.

Кроме того, изучение способов химической модификации гемоглобина предполагает решение проблемы использования его производных в качестве эффективных кровезаменителей (Н.П. Кузнецова, Л.Р. Гудкин, Р.Н. Мпшаева, 1996; S. Hiromi et al., 1996). Для этого может быть полезным изучение сочетания кислородтрэкспортных свойств гемоглобина с антиоксидантными свойствами супероксиддисмутазы и каталазы (Е.А. Quebec, T.M.S. Chang, 1995; F. D'Agnillo, T.M.S. Chang, 1998). Следовательно, актуальна проблема исследования физико-химических свойств полифункциональных белковых молекул.

В то же время бесспорно огромное влияние, которое оказывают биологически активные виды электромагнитных излучений, в частности УФ-свет, на существование живых систем. Весьма актуальным стало исследование механизмов действия на биообъекты УФ-излучения с длинами волн 240-300 нм в связи с развитием космических исследований, с разрушением озонового слоя Земли - естественного экрана против проникновения коротко- и средневолнового ультрафиолета. Для устранения его неблагоприятного влияния на биологические системы значительное развитие получил поиск различных химических модификаторов их фоточувствительности. Среди таких веществ особенно эффективным оказался 5-гидроксотриптамин (серотонин), относящийся к классу индолилалкила-минов и широко применяющийся в настоящее время в клинической практике. Было установлено, что серотоїшн образует комплекс с целым рядом белков, чем, вероятно, и обусловлены его протекторные свойства. Для детализации представлений по указанной проблеме удобным оказалось использование модели гемоглобин-серотонин, поскольку, с одной стороны, эти соединения формируют между собой устойчивый комплекс, а с другой - хорошо известна структура гембелка и типы связей, поддерживающих его функционально активную конформацию. Поэтому неудивительно, что исследованиям в этой области посвящено большое количество работ. Благодаря им, к настоящему времени во многом изучены природа и механизмы данного взаимодействия.

Следует отметить, что одшім из наиболее важных экологических факторов, под постоянным действием которого находятся все живые организмы, является длинноволновое УФ-излучение (Х.= 320-400 нм). Однако до настоящего времени остается не до конца ясным вопрос о природе хромофоров гемоглобина, ответственных за поглощение света в диапазоне длин волн 320-400 нм, а также о роли их модификации в проявлении гем-бслком своей функциональной активности.

Цель и задачи диссертационной работы. Целью нашей работы явилось определение степени УФ-чувствительности молекул гемоглобина с различным субъединичным строением в присутствии серотонина.

В связи с этим nqjeA нами стояли следующие задачи:

1. Изучить УФ-чувствительность димеров гемоглобина.

2. Проанализировать влияние УФ-света и серотонина на структурно-функциональные свойства гибридов валентности, образующихся в смеси растворов окси- и метгемоглобина.

3. Изучить влияние ДУФ-света на структуру и функциональные свойства молекул гемоглобіша с различным субъединичным составом.

4. Исследовать сочетанное воздействие УФ-света и серотонина на кислородсвязывающие свойства молекул полигемоглобина.

5. Изучить влияние УФ-света и серотошша на структурно-функциональные свойства полигемоглобина, связанного поперечными сшивками с молекулами супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы.

Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным выявлению взаимосвязи между структурным состоянием и функциональной активностью (кислородсвязывающие и антиоксидант-ные свойства) молекул гемоглобіша с различным субъединичным составом. Анализ полученных результатов выявил важную роль субъединичных контактов в ответной реакции молекул гемоглобина на воздействие УФ-нзлучения широкого спектрального состава. Установлено, что серотоніні (соотношение молекул гемоглобинхеротонин 1:10) не оказывает фотопротекторного действия на димеры гемоглобина (М=37,3±0,5 кДа). На основании экспериментальных данных сделан вывод о том, что в случае разрушения субъединичных контактов биогенный аміга способен присоединяться к гемоглобину как по неспецифическим участкам связывания в апобелке, так и в области гема.

Выявлен фотопротекторный эффект серотонина по отношению к кислородсвязывающим свойствам гибридов валентности, молекул поли-гемоглобнна, комплексов полигемоглобин-СОД (соотношение молекул гемоглобіша и серотошша 1:10). Использование различных структурных форм гемоглобина показало, что комплексообразование гембелка с се-ротонином при указанном соотношении компонентов происходит в специфических участках апобелковой части, затрагивающих субъединичные контакты.

Установлено, что ведущая роль в фотомодификации кислородсвязы-вающих свойств гибридов валентности гемоглобіша принадлежит процессу диссоциации тетрамеров гембелка на димеры. Однако выявленные в ходе проведения экспериментов нарушения кнслородсвязывающих свойств полигемоглобина после УФ-облучения в дозах 151 и 604 Дж/м²

(Р₅₀=7,5±0,7 и 7,410,5 мм рт. ст., а = 1,45±0,06 и 1,40±0,07 соответственно) обусловлены не процессами диссоциации его молекул, а перестройками высших типов структурной организации (третичной и четвертичной) белковых макромолекул. Образование поперечных связей между молекулами полигемоглобина и СОД (каталазы) приводит к формированию подифун-кциональных комплексов, сочетающих как кислородтранспортные, так и антиоксидантные свойства. Анализ влияния УФ-света на эти ассоциаты показал, что каталаза способна оказывать фотозащитное действие по отношению к функциональным свойствам полигемоглобина при больших дозах облучения (604 Дж/м²), чем СОД (151 Дж/м²).

Показано, что ДУФ-облучение (320-40 гемоглобина в дозах 1,9-9,5 Дж/м² индуцирует локальные (обратимые) перестройки апобелка в области окружения гема, увеличивающие сродство гемоглобина к кислороду. Повышение доз ДУФ-облучения до 19-144 Дж/м² вызывает миграцию "конформацнонных изменений" внутри апобелка, которая приводит к необратимым перестройкам в области контактов субъединиц, снижающим кооперативный эффект связывания кислорода гембелком.

Практическая значимость. Разработана схема возможных процессов фотомодификации молекул гемоглобина с различным субъединичным составом, которая позволяет расширить современные представления о механизмах развития ответной реакции гемоглобина на воздействие УФ-света различного спектрального состава. Она может быть использована при обсуждении механизмов влияния экологических факторов на биосистемы.

Предложена схема возможных реакций взаимодействия молекул се-ротонина с гемоглобином в области субъединичных контактов гембелка. Ее можно использовать при разработке научных основ химической модификации радио- и фоточувствительности биологических объектов, при построении имитационных моделей взаимодействия белок-лиганд.

Экспериментальные данные, полученные при анализе кислородсвя-зывающих и антиоксидантных свойств комплексов полигемоглобин-СОД и полигемоглобин-каталаза, могут быть полезными при использовании реперфузионных растворов, применяемых, напряму», при ишемических заболеваниях.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры биофизики и биотехнологии при чтении курсов "Фотобиология" и "Общая биофизика".

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на I Всероссийской конференции фотобиологов (Пушино, 1996); Совещании-семинаре "Первичные фотофизические и фотохимические процессы в биоспстемах различных уровней организации" (Воронеж, 1996); Между-

* I

народной школе "Проблемы теоретической биофизики" (Москва, 1998); 13-м Международном конгрессе по фотобиологии (Сан-Франциско, 2000); Седьмой международной конференции по химии и физикохимии олиго-меров "Олигомеры-2000" (Пермь, 2000); Научной сессии сотрудников Воронежского госушшерситета (Воронеж, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 3 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

6. УФ-излучение с длинами волн 240-390 им индуцирует нарушение областей контактов а, и р₂ субъединиц в молекуле гемоглобина.

7. Присоединение серотошша в местах субъединичных контактов к гибридам валентности, образующимся в смеси оксигемоглобина и метге-моглобина, оказывает фотопротекторное действие по отношению к кис-лородсвязывающим свойствам гибридных молекул.

8. Серотонин проявляет фотопротекторный эффект по отношению к полигемоглобину.

9. Схема взаимодействия серотошша с гемоглобином в области субъе-дшшчных контактов гембелка.

10. Каталаза и СОД, связанные поперечными связями с полигемоглобином, оказывают фотопротекторное действие по отношению к гембел-ку.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 152 страницы машинописного текста, 2 таблицы, 36 рисунков. Состоит из введения, семи глав, заключеїшя и выводов. Список литературы содержит 157 работ, из них 85 - отечественных и 72 - зарубежных.