Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Исследование механизмов генерации и переноса энергии при работе различных ферментативных систем является одной из актуальных задач биохимии. При проведении такого рода исследований весьма привлекательны и перспективны ферменты и ферментные системы, катализирующие биолюминесцентные реакции. В ходе зтих реакций с высокой квантовой эффективностью происходит преобразование химической энергии субстратов люциферазы в свет. За последние три десятилетия накоплен значительный опыт по расшифровке биохимических реакций, ведущих к высвечиванию. Однако, остается ряд невыясненных вопросов и спорных моментов. Непонятна, например, роль свечения в общем метаболизме клетки, неизвестен механизм формирования электронно-возбужденного состояния люциферазы и т.д. Это связано с тем, что изучение механизмов высвечивания проводят либо in vitro на модельной смеси люцифераз и их субстратов, либо с использованием целых бактериальных клеток. Использование интакт-ных организмов корректнее, но проведение экспериментов затруднено, так как работает сложная цепь метаболических процессов, а клеточная оболочка препятствует прямому манипулированию с клеточным содержимым. Вязкость среды и микроокружение люциферазы в клетке значительно отличаются от условий функционирования in vitro.
Иммобилизованная в гель люцифераза, аналогично ферменту внутри иятактной клетки, встроена в матричную структуру. Иммобилизация позволяет создавать определенное микроокружение ферментов биолюминесценции . связанных с нерастворимым носителем (микро-рН, диэлектрическая проницаемость, отличие гидрофоб-но-гидрофильных свойств примыкающих к ферменту групп от свойств воды и т.д.) (Березин И. а, 1990 г.). По-видимому, изучение иммобилизованных ферментов может приблизить нас к пониманию процессов биолюминесценции, происходящих in vivo.
Впервые люцифераза была иммобилизована в 1970 году (Erlanger В. F. et al, 1970) . В настоящее время предложено более десятка способов и носителей для иммобилизации люциферазы и сопряженных с ней ферментов (Blum L. J., Coulet P. R, 1993). Это методы иммобилизации бактериальной люциферазы на сефарозе, агарозе, нейлоне, коллагеновых пленках, ариламинированных
стеклянных бусах, полиакриловой кислоте, гелях из альбумина, сшитых глутаровым альдегидом и т. д. Большинство методов иммобилизации люцифераз было создано и успешно используется для аналитических целей. Исключение составляет лишь иммобилизованная в биогедь люцифераза, с помощью которой изучали механизмы реакции бактериальной биолюминесценции, в частности взаимодействие с альдегидами, оборот фермента, свойства додгоживуще-го интермедиата люцифераэы (Erlanger Б. F. et al. 1970). Однако, связывание люциферазы с биогелем происходит с участием активных групп фермента, важных для катализа Это приводит к существенной инактивации фермента и мешает правильной количественной интерпретации результатов. Вместе с тем, существует возможность иммобилизации люциферазы, при которой не происходит ковалентного взаимодействия с активными группами фермента и полностью сохраняется его активность. Это методы иммобилизации в нейтральные гели, такие как гель крахмала
Изучение свойств иммобилизованной в крахмальный гель люциферазы и сравнение ее каталитических характеристик с растворимой позволит приблизиться к пониманию процессов, происходящих в нативной клетке.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ, Цель настоящей работы - изучение влияния гелевого окружения на биферментную систему бактерий: NADH: РШ-оксидоредуктаза-люцифераза Были поставлены следующие задачи:
-
Изучить зависимости характеристик иммобилизованной би-ферментной системы от условий иммобилизации в крахмальный гель для получения препаратов иммобилизованных ферментов с заданными свойствами.
-
Изучить влияния гелевого окружения на кинетические характеристики и стабильность биферментной системы: NADH: FMN-ок-сидоредуктаза-люцифераза
-
Осуществить совместктю иммобилизацию ферментов и субстратов бактериальной биолюминесценции. Разработать многокомпонентный иммобилизованный реагент для биолюминесцентного анализа
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Получены зависимости характеристик иммобилизованной биферментной системы от условий иммобилизации.
являющиеся основой для разработки алгоритма получения иммобилизованных препаратов с заданными свойствами. Показано, что в геле увеличивается термостабильность биферментной системы и константы Михаэлиса по субстратам; уменьшаются константы инактивации под влиянием ионов водорода и высоких концентраций солей.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Получены результаты, позволяющие разработать алгоритм создания иммобилизованного препарата с заданными свойствами: состав, выход активности, кратность использования, устойчивость к химическим факторам среды (рН, ионная сила растворов). Получен высокоактивный препарат. включающий все компоненты биферментной системы in vitro (НАОН:РШ-оксидоредукгаза. люцифераза, FMN, NADH, DTT, тетра-деканаль). Показана возможность использования полученного семейства реагентов сложного состава для тестирования ксенобиотиков и анализа субстратов биолюминесцентной реакции.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИШЕ НА ЗАЩИТУ:-
-
Зависимости характеристик иммобилизованной биферментной системы от условий иммобилизации. Алгоритм получения иммобилизованного препарата с заданными свойствами: состав, выход активности, кратность использования, устойчивость к химическим факторам средь (рН, ионная сила растворов).
-
Показано, что в гелевом окружении сохраняется каталитическая активность биферментной системы, увеличивается термостабильность ферментов и константы Михаэлиса по субстратам, уменьшается инактивации ферментов в кислой и щелочной среде и при высоких концентрациях солей.
-
Получен многокомпонентный иммобилизованный люциферазный реагент для биолюминесцентяого анализа.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы докладывались на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущи-но, 1990), на IV Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение" (Москва, 1992), на 11 Международном биофизическом конгрессе (Будапешт. Венгрия, 1993), на Международном биолюминесцентном симпозиуме (Гаваи. 1993), на Международной конференции по клини-
ческой хемилшинесценции (Берлин, Германия, 1994). Международная конференция "Environmental Pollution and Neuroimmuno Interactions and Environment" (Россия, С-Петербург, 1995).
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, 6 тезисов.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, трех глав с изложением результатов работы, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (156 источников, в т. ч. - 96 на английском языке). Диссертация иллюстрирована 29 рисунками, содержит 11 таблиц.