Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
1. 1. Методы микроинъекции (МИ) 9
1. 2. Выживаемость зародышей животных и
человека после МИ 11
1. 3. Ранний эмбриогенез мыши, стадия бластоцисты 12
1. 4. Ростовые факторы и цитокины в раннем развитии зародышей 19
1. 5. Роль цитокина LIF в эмбриогенезе и имплантации 22
1. 6. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) мыши 26
1. 7. Методы получения ЭСК 30
1. 8. Химерные зародыши и животные 34
ГЛАВА II 40
Материал и методы 40
2. 1. Биологический материал 40
2. 2. Ранние зародыши мыши 40
2.2.1. Выделение зародышей на стадии бластоцисты 40
2.2.2. Культивирование бластоцист in vitro 41
2.2.3. Выявление биологических эффектов цитокина LIF на стадии бластоцисты 41
2. 3. Клеточные культуры 42
2.3.1. Выделение первичных эмбриональных фибробластов (ПЭФ) мыши 42
2.3.2. Культивирование клеток ПЭФ 43
2.3.3. Приготовление митомицинового фидера ПЭФ 43
2.3.4. Культивирование ЭСК мыши 44
2.3.5. Культивирование и трансфекция клеток линии Cos-1 44
2. 4. Микроинъекция (МИ) 45
2.4.1. Оборудования для проведениями 45
2.4.1. МИ в бластоцисты растворов и целых клеток 46
2. 5. Оценка жизнеспособности бластоцист мыши в условиях культуры in vitro 47
2.5.1. Цитохимический тест на выявление эндогенной щелочной фосфатазы (ЭЩФ) 48
2.5.2. Иммуноцитохимическое определение фактора транскрипции плюрипотентных клеток - Nanog 49
2. 6. Криоконсервация клеточных культур 49
2.6.1. Замораживание и хранение ЭСК,
ПЭФ и Cos-1 в жидком азоте 49
2.6.2. Режимы замораживания и размораживания клеточных культур 50
2. 7. Состав сред и растворов, используемых для культивирования клеток и ранних зародышей 50
2.7.1. Модифицированная среда Виттена (МСВ) 50
2.7.2. Фосфатно-солевой буфер PBS 51
2.7.3. Раствор Версен-ЭДТА 51
2.7.4. Трипсин-ЭДТА 51
2. 8. Статистическая обработка результатов 51
ГЛАВА III 52
Результаты и обсуждение 52
3.1. МИ в полость бластоцисты среды Виттена и витальных красителей 52
3.1.1. Морфофункциональные особенности бластоцист после МИ 52
3.1.2. Развитие зародышей мыши со стадии бластоцисты in vitro 60
3.1.3. Межлинейные различия в эффективности культивирования бластоцист после МИ 66
3.1.4. Влияние цитохалазина Б на эффективность культивирования мышиных бластоцист 71
3.1.5. Повышение эффективности культивирования бластоцист мышей в среде с цитокином LIF 73
3.1.6. МИ цитокина LIF в полость бластоцисты 78
3. 2. Получение химерных бластоцист мыши 82
3.2.1. Распределение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в полости бластоцисты после МИ 83
3.2.2. МИ в полость бластоцисты трансфицированных клеток линии Cos-1 85
3.2.3. Оценка флуоресценции зеленого белка GFP в первичных эмбриональных фибробластах (ПЭФ) мыши после МИ в бластоцисту 90
3.2.4. Эффективность развития химерных бластоцист мыши в культуре 94
Глава IV 97
Выводы 97
Список литературы
- Ростовые факторы и цитокины в раннем развитии зародышей
- Выявление биологических эффектов цитокина LIF на стадии бластоцисты
- Морфофункциональные особенности бластоцист после МИ
- Распределение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в полости бластоцисты после МИ
Введение к работе
Проблема терапевтического и репродуктивного клонирования стала одной из самых популярных проблем современной клеточной биологии и медицины (Kuhholzer, Prather, 2000; Solter, 2000; Kawase et al, 2000; Wolfe/ al, 2001; Illmensee, 2002; Wakayama et al, 2005; Hochedlinger, Jaenisch, 2003, 2006). Одним из подходов для ее решения является микроинъекция (МИ) в ооциты или ранние зародыши чужеродных ядер, ДНК и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), которые обладают уникальной способностью встраиваться в развитие зародыша и передавать свои признаки по наследству (Bradley et al, 1984; Robertson, 1986; Perry et al, 1999; Baguishi et al, 1999; Nagy et al, 1987; Nagy, Rossant, 2001; Nagy et al, 2003).
В последние годы методы МИ нашли практическое применение в работах по лечению бесплодия человека с помощью экстракорпорального оплодотворения - ЭКО, когда отдельный сперматозоид водится в цитоплазму ооцита (Галат, 2000; Lundin et al, 2001; Yoshida, 2007; Jones et al, 2008). Другая область применения МИ связана с решением проблем клонирования ЭСК животных и человека с генетически измененными свойствами (Wakayama et al, 2001; Hochedlinger, Jaenisch, 2003, Hwang et al, 2005; Hochedlinger, Jaenisch, 2006). После замены ядра ооцита на ядро таких клеток получают зародыши, генетический материал которых соответствует геному донора.
Подавляющее большинство исследований с применением техники МИ выполнено на экспериментальных моделях, в качестве которых использовали лабораторных мышей. Из этих работ следует, что выживаемость мышиных ооцитов после замены ядер не превышает 1-2 % из-за низкой способности соматических и эмбриональных ядер к репрограмированию в цитоплазме зрелого ооцита (Illmensee, Норре, 1981; Wilmut et al, 1997; McLaren, 2000; Hochedlinger, Jaenisch, 2003; Hwang et al, 2004). По данным литературы более высокий процент выживаемости реконструированных зародышей достигается при инъекции ЭСК в полость бластоцисты, как источника чужеродного генетического материала (Bradley et al, 1984; Robertson, 1986; Nagy et al, 1987;
Nagy, Rossant, 2001; Rossant, 2001; Nagy et al, 2003). В этом случае из реконструированных бластоцист можно получить более 20 % генеративных химерных животных. Этот метод находит применение в различных трансгенных и ген-таргетированных технологиях с использованием в качестве векторных систем ЭСК.
В современной литературе господствуют представления о том, что способность инъецированных клеток встраиваться в развитие зародыша и его гаметогенез зависит от плюрипотентных свойств ЭСК (Robertson, 1986; Robertson et al, 1987; Bradley et al, 1992; Brown et al, 1992; Papaioannou, 1993; Yagi, 1993; Ueda et al, 1995; Longo et al, 1997; Rossant, Spence, 1998; Prelle et al, 1999; Rossant, 2001). При этом остаются в стороне и не рассматриваются вопросы влияния самой процедуры МИ на последующее развитие и выживаемость химерных зародышей и их способность продуцировать первичные колонии эмбриональных клеток в условиях in vitro.
Кроме того, недостаточно внимания уделяется вопросам влияния генома зародыша на свойства и межклеточные взаимодействия ЭСК на начальных этапах развития в составе бластоцисты, а также факторам, индуцирующим эти процессы in vitro. Плюрипотентные ЭСК мыши с одинаковой вероятностью включаются как в экстраэмбриональные ткани, так и в ткани самого зародыша. Выбор направления развития инъецированных клеток во многом носит случайный характер, и причины выбора остаются неизвестными. В связи с этим нам представлялось весьма интересным изучить характер распределения инъецированных клеток в составе бластоцисты и выяснить регуляторные возможности самих зародышей, оценить их способность к восстановлению морфологии и жизнеспособности после повреждений, вызванных МИ. Результаты таких исследований могут представлять большой интерес в медицинской практике.
Основной целью настоящей работы было получение с помощью метода МИ химерных бластоцист мыши и выявление характера распределения
инъецированных эмбриональных и соматических клеток в химерном зародыше на начальных этапах его развития. Решали следующие задачи:
Оценка жизнеспособности бластоцист различных линий мышей in vitro после МИ в полость растворов витальных красителей, среды культивирования, эмбриональных и соматических клеток.
Исследование межлинейных различий в реакции бластоцист на МИ. Оценка характера повреждений бластоцист.
Разработка методических приемов для повышения эффективности культивирования мышиных бластоцист in vitro.
Оценка влияния цитокина LIF на развитие бластоцист в зависимости от способа его действия: опосредованно через среду культивирования или путем введения в полость бластоцисты.
Подбор генетических маркеров и флуоресцентных красителей для идентификации инъецированных соматических и эмбриональных клеток в составе бластоцисты. Оценка характера их встраивания в бластоцисту.
Получение химерных бластоцист и выявление различий в эффективности их культивирования в зависимости от генома инъецированных клеток.
Ростовые факторы и цитокины в раннем развитии зародышей
Взаимодействие между двумя типами клеток ВКМ и ТБ на ранних стадиях развития осуществляется путем ауто- и паракринной регуляции. Сигнальные молекулы (ростовые факторы, цитокины, факторы транскрипции, вторичные метаболиты), секретируемые клетками эмбриона и репродуктивного тракта, влияют на скорость роста и продвижение эмбриона по яйцеводу, а также участвуют в имплантации. В настоящее время накоплен огромный экспериментальный материал о механизмах действия этих биологически активных молекул на разные типы клеток-мишеней в процессах эмбриогенеза (Williams, etaL, 1988; Stewarts al, 1992; Adamson, 1993; Stewart, 1994; Kovere/ al, 1995; Stewart, Cullinan, 1997).
Существует предположение о том, что ранние зародыши млекопитающих могут синтезировать собственные ростовые факторы (Adamson, 1993; Stewart., Cullinan, 1997; Petraglia et al, 1998; Roberts et al, 1999), поэтому их развитие не так сильно зависит от материнского организма. По крайней мере, это может относиться к доимплантационному периоду, когда связь зародыша с матерью минимальна и, возможно, ограничивается только механическим перемещением зародыша в пределах репродуктивного тракта по направлению к матке.
Известно, что в течение короткого промежутка времени зародыши мыши могут обеспечивать свои энергетические потребности за счет резервов ооцита и раннего включения собственных генов (Дыбан, 1988; Hogan et al, 1994). Но на стадии бластоцисты, когда зародыш перемещается в матку, на него действуют ростовые факторы и цитокины, секретируемые в матке и необходимые для выхода из z. pellucida и имплантации (Adamson, 1993;. Stewart, Cullinan, 1997; Brizon, Schultz, 1997; Kimber, 2005).
Поиск аутокринных регуляторов, участвующих в доимплантационных процессах, привел к некоторым очень важным открытиям. Биологически активные молекулы, которые раньше считались митогенами, оказались вовлеченными во многие процессы раннего развития. Это нашло подтверждение в опытах in vitro и in vivo (Stewart et al, 1992; Baker et al., 1993; Mann et al, 1993; Soriano, 1994; Lau et al, 1994; Lee et al., 1995; Ware et al., 1995; Cohen et al., 1996; Ludwig et al., 1996; Bostrom et al., 1996). Было выявлено свыше 20 факторов, которые в той или иной степени участвуют в раннем развитии зародышей (Adamson, 1993; Cross et al, 1994).
Среди этих факторов обнаружен эпидермальный фактор роста (EGF), который рассматривается как наиболее важный регулятор пролиферации в нормальных тканях взрослого организма, а также фактор злокачественной трансформации клеток — TGFa. Оба фактора функционируют как паракринные регуляторы. Показано, что TGFa продуцируется на стадии бластоцисты в клетках ВКМ и полярных клетках трофоэктодермы (Rappolee et al., 1990; Adamson, 1993; Pampfer, 1994).
Эти факторы при действии на зародыши стимулируют белковый синтез в клетках трофобласта, процессы кавитации и образование полости бластоцисты, а также способствуют увеличению числа бластомеров (Adamson, 1993). Однако специфика действия EGF больше направлена на активацию дифференцировки клеток зародышей, чем на их пролиферацию. Предположительно это происходит за счет увеличения активности генов, ответственных за ионный транспорт, что имеет решающее значение в процессах формирования ТБ.
Полагают, что рецепторные белки EGF и TGFa участвует в имплантации (Рагіа et al, 1993; Smith et al, 1997; Carlson et al, 2000). На поверхности клеток люминального эпителия матки выявляется мембраносвязанная форма TGFa, которая может взаимодействовать с рецепторами на клетках бластоцисты. В этом случае возможна паракринная регуляция, и роль рецептора сводится к специфической адгезии клеток ТБ к эпителию матки.
Нокаут по гену TGFa -/— с использованием ЭСК мыши выявил различные дефекты и отклонения в их развитии, но мутация была не летальной (Luetteke et al, 1993; Mann et al, 1993). Из этих данных следует, что TGFa является необходимым, но не обязательным фактором в до- и постимплантационном развитии зародышей мыши.
Ранние зародыши со стадии 4-х бластомеров и до бластоцисты транскрибируют и транслируют мРНК семейства TGFp (Rappolee et al., 1990, 1994; Paria et al., 1992). Добавление этого фактора в среду культивирования способствует устранению блока развития на 8-ми клеточной стадии у зародышей коров. Полагают, что этот белок также участвует в процессах имплантации (Das et al., 1992).
Как уже отмечалось выше, в процессах имплантации участвует большое количество различных ростовых факторов и цитокинов, в том числе и колония-стимулирующий фактор I (CSF-1), максимальная активность которого проявляется на стадии бластоцисты (Adamson, 1993; Bhatnagar et al., 1995). Рецепторные белки CSF-1, расположенные на поверхности клеток ТБ, играют важную роль в специфическом взаимодействии зародышей с эндометрием матки во время имплантации (Bhatnagar et al., 1995).
В раннем эмбриогенезе на стадии бластоцисты у человека, а также в 2-клеточных и 8-ми дневных зародышах мыши обнаруживается тромбоцитарный ростовой фактор PDGF (Svalander et al., 1991; Palmieri et al., 1992). Его функциональная активность зависит от типа и вида клеток-мишеней. В частности, in vitro показано, что этот фактор снимает блок развития зародышей коров на 8-ми клеточной стадии (Larson et al., 1992), однако на последующее их развитие он действует как ингибитор.
У мышей выявлена мутация Pach, которая связана с уменьшением активности PDGF-рецепторного гена, что приводит к гибели зародышей в конце второй половины беременности (Schatteman et al., 1992; Morrison-Graham et al., 1992; Orr-Urtreger et al., 1992). Из этого можно сделать вывод, что отсутствие активности PDGF и его рецепторных белков не влияют на доимплантационное развитие.
Выявление биологических эффектов цитокина LIF на стадии бластоцисты
ЭСК мыши линии R1 культивировали в среде ДМЕМ (Sigma, США) с добавлением 15-20 % фетальной сыворотки коров (Sigma, США), 2 мМ L-глютамина, 0.1 мМ меркаптоэтанола (Sigma, США), 50 мкг/мл антибиотиков-антимикотиков (Sigma, США), 1 мМ нуклеозидов (Sigma, США) и 1% незаменимых аминокислот (Gibco, США). Цитокин LIF добавляли в среду в концентрации 10 нг/мл (PeproTech.inc, США), которая обычно используется для культивирования ЭСК мыши (Evans, Kaufman, 1983; Pease et al., 1990; Robertson, 1987).
ЭСК высевали в концентрации 90-100 тысяч клеток на 35 мм пластиковые чашки Петри (Costar, США; Nunc, Нидерланды), предварительно покрытые 0.1% желатиной (ICN, США) или на митомициновый фидер ПЭФ и культивировали при 37 С во влажной атмосфере и давлении 5% С02 (Sanyo, Япония). Через каждые 24 ч проводили полную смену питательной среды с добавками для ЭСК. Через 3-4 суток развившиеся в виде колоний ЭСК пересаживали на свежий фидер ПЭФ или 0.1 % желатиновые чашки. Перед пассированием колонии ЭСК дважды промывали раствором Версен-ЭДТА, после чего заливали 0.05 % трипсин-ЭДТА и оставляли на 3-5 мин в С02-инкубаторе при 37С. Трипсин инактивировали путем добавления в питательную среду ДМЕМ 10 % фетальной сыворотки и осторожно пипетировали клетки до состояния суспензии.
Перед трансфекцией Cos-1 высевали из расчета 100 тысяч клеток на 35 мм чашки Петри (Nunc, Нидерланды) и через 24 ч культивирования, когда они достигали 70 % монослоя, проводили трансфекцию с помощью 1.0 мкг/мл плазмидной ДНК pEGFP-Cl (Invitrogen) и агента липофектамина 2000 (Invitrogen) по методу (http://www.invitrogen.com).
Плазмидный вектор pEGFP-Cl в трансфицированных клетках экспрессирует ген gfp и селективный ген пео, определяющий устойчивость к селективному антибиотику генетицину (G418). Селекцию трансфицированных клеток Cos-1 проводили в течение 2-х недель в среде с 300 мкг/мл селективного антибиотика G418 (ICN, Sigma, США). Устойчивые к G418 клетки, продуцирующие флуоресцентный белок GFP, использовали для микроинъекции в бластоцисту.
Процедуру МИ проводили на микроманипуляторе TransferMan NK (Eppendorf, Германия) под инвертированным микроскопом IX-70 (Olympus, Япония), дополнительно оснащенным объективом в модификации Хоффмана (рис. 2) для увеличения разрешающей способности и получения объемного изображения при работе с прозрачными объектами - зародышами мышей на стадии бластоцисты.
Для МИ в полость бластоцисты растворов и целых клеток использовали стандартные инструменты фирмы Eppendorf (Германия), предназначенные для работы на изолированных зародышах и клеточных культурах. Размеры и характеристики этих инструментов рассчитаны таким образом, что они наносят минимальный вред зародышу от механических повреждений.
Инъекционные иглы TransferTip (ES) имели следующие параметры: общая длина иглы - 55 мм, угол наклона 20 (для работы на стекле и в чашках Петри), длина кончика иглы - 1 мм, внешний диаметр 20 мкм, внутренний диаметр 15 мкм. Присоски VacuTip: общая длина - 49 мм, угол наклона 35, длина кончика присоски 1 мм, внешний диаметр 100 мкм, внутренний диаметр 15 мкм.
Используемые нами инструменты: иглы для инъекции клеток TransferTip (ES) и присоски VacuTip для фиксации зародыша сертифицированы, проверены на цитотоксичность, стерильны.
МИ растворов. Для поддержания более высокого тургора в полости бластоцисты и повышения эффективности МИ эту процедуру проводили в МСВ, разбавленной дистиллированной водой (10 %). В полость бластоцисты вводили 7-10 нл МСВ или такое же количество витальных красителей: 0.03 % трипанового синего (Fluka, Швейцария) и 0.1 % фенолового красного (Sigma, США) для визуального контроля эффективности МИ.
При оценке биологических эффектов «эндогенного» цитокина LIF мыши (Sigma, США) в бластоцисты инъецировали белок в концентрациях 0.65, 0.33, 0.15 и 0.07 пг/нл. Цитохалазин Б (ICN, США) использовали в концентрации 5 мкг/мл в МСВ.
МИ клеток. В опытах по МИ в полость бластоцисты клеток использовали мышиные ЭСК линии R1, а также клетки ПЭФ мыши с постоянной экспрессией гена gfp, выделенные из трансгенных мышей линии C57Bl/6TgN(ACTbEGFP)10sb, и клетки перевиваемой линии Cos-1, предварительно трансфицированные плазмидным вектором pEGFP (глава 2.3.5).
Для визуализации инъецированных ЭСК в полости бластоцисты эти клетки переводили в суспензию и инкубировали в течение 1 ч в растворе PBS с 1.0 мкг/мл доксорубицина-Ферейн (ЗАО «Брынцалов-А», Россия), после чего клеточную суспензию дважды промывали в PBS и переносили в МСВ для МИ (Nagye?a/.,2003).
В полость каждой бластоцисты инъецировали в среднем по 7 ЭСК или соматических клеток, предварительно маркированных флуоресцентным белком GFP. После МИ бластоцисты помещали в среду для культивирования зародышей мыши (см. 2.2.2) с целью оценки их способности к дальнейшему развитию.
Распределение и встраивание разных типов клеток в состав бластоцисты регистрировали под инвертированным микроскопом Axiovert 40 CFL (Zeiss, Германия) при длине волны 488 нм, а также на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе LSM510 МЕТА (Zeiss, Германия).
Морфофункциональные особенности бластоцист после МИ
Реконструкция зародышей, связанная с МИ растворов сред и целых клеток в ранние зародыши на стадии бластоцисты, неизбежно приводит к повреждению плазматических мембран бластоцисты, а также нарушению целостности z. pellucida. Такое повреждающее механическое воздействие процедуры МИ может негативно повлиять на дальнейшее развитие и вызвать гибель зародыша. Чтобы оценить степень повреждения клеток бластоцисты в результате прокола плазматических мембран и z. pellucida использовали среду Виттена и витальные красители в качестве маркеров эффективности МИ.
Зародыши мыши на стадии бластоцисты, а также инъецируемые в их полость растворы, как правило, прозрачны, поэтому для визуализации прокола нами были выбраны нетоксичные для живых клеток витальные красители: 0.03% трипановый синий и 0.1 % феноловый красный (рис. 3, а-г).
Перечисленные выше растворы красителей, а также модифицированную среду Виттена (МСВ) (рис. 3, д, е) вводили в бластоцисты мышей линии SHK в количестве 7—10 нл. Следует отметить, что МСВ использовалась нами также и для культивирования мышиных зародышей до стадии бластоцисты и последующего формирования из бластоцист колоний ЭК (Березовская и др., 1986; Капралова и др., 2006; Межевикина и др., 2006 а), что подтверждает сбалансированность этой среды по солевому составу для этого вида животных.
Как видно на рис. 3, при введении иглы через z. pellucida и ТБ растворы проникают в полость бластоцисты. При этом бластоциста набухает и увеличивается в объеме. Увеличение объема бластоцисты свидетельствует о том, что значительная часть введенной жидкости остается в полости. Наглядно это продемонстрировано в опытах с использованием двух витальных красителей, сохраняющихся в полости бластоцисты (рис. 3, а-г). Рисунок 3. Микроинъекция в полость бластоцист мыши линии SHK витальных красителей: 0.03 % трипанового синего {а, б), 0.1 % фенолового красного {в, г) и модифицированной среды Виттена (д, ё). В полость каждой бластоцисты растворы вводили в количестве 7-10 нл.
Следует отметить, что зародыши мыши на стадии бластоцисты обладают чрезвычайно высокой пластичностью, и могут сами регулировать свой объем. Тот объем жидкости, который не вмещается в полости бластоцисты и/или является критичным для сохранения морфологии, выходит через отверстие в области прокола, окрашивая окружающую среду (рис. 3, а, в). Можно предположить, что таким способом бластоцисты во время проведения МИ уравновешивают осмотическое давление (тургор) в полости и перивителлиновом пространстве с давлением во внешней среде, что необходимо для поддержания нормальной морфологии. Однако в некоторых случаях МИ возможна небольшая деформация бластоцисты в месте прокола (рис. 3, д), что по нашим наблюдениям не приводит к значительным нарушениям морфологии после извлечения иглы (рис. 3, е). Выход избытка жидкости из полости бластоцисты начинается довольно быстро, когда зародыш находится на присоске, о чем свидетельствует увеличение объема перивителлинового пространства и сокращение объема самого зародыша, наблюдаемые после извлечения иглы (рис. 3, 6, г, е). При этом морфология бластоцисты сохраняется. Видны клетки ТБ и ВКМ, а также полость бластоцисты.
После снятия бластоцисты с фиксирующей микропипетки усиливаются процессы выхода избыточного количества жидкости в перивителлиновое пространство, в результате чего наблюдаются видимые структурные изменения, сопровождающиеся исчезновением полости бластоцисты и расположением клеток ВКМ и ТБ (рис. 4, а). По своей морфологии такие бластоцисты больше напоминают зародышей на стадии начала компактизации: у них отсутствует полость, хорошо обозначено перивителлиновое пространство, отчетливо видны границы отдельные крупных клеток.
Рисунок 4. Морфология бластоцист после микроинъекции средой Виттена (а) -сразу окрашенных 0.5% трипановым синим и {б) - через 24 ч in vitro. Стрелками указаны поврежденные клетки. Было показано, что видимые нарушения морфологии после МИ среды МСВ и витальных красителей нивелируют в течение 3 ч инкубирования бластоцист — «компактных морул» в МСВ. Через 24 ч «компактные морулы» восстанавливают форму нормальной бластоцисты до средней и поздней стадии, основными характеристиками которых являются наличие соответствующих размеров полости внутри и строгое распределение по морфологии и расположению в зародыше клеток ВКМ и ТБ относительно друг друга (рис. 4, б).
Было установлено, что в результате МИ в бластоцисте повреждаются только те клетки, которые располагаются по ходу введения иглы (рис. 4, а, обозначены стрелками). Поврежденные клетки окрашиваются витальным красителем 0.5% трипановым синим, что свидетельствует об отсутствии барьерных свойств плазматических мембран, что приводит в последствии к их гибели. Через 24 ч культивирования инъецированных бластоцист поврежденные и нежизнеспособные клетки, исходно находящиеся в составе бластоцисты, смещаются в направлении трофобласта и выходят в перивителлиновое пространство (рис. 4, б, обозначены стрелками), что также указывает на сложные межклеточные взаимодействия, высокую пластичность и восстановительную способность зародышей на стадии бластоцисты.
Диффузия трипанового синего после МИ в полость бластоцисты 0.03 % раствора этого красителя и МСВ показана на рис. 5. Из этих данных следует, что основная масса красителя выходит из полости бластоцисты в течение первых 3 ч инкубирования. К этому времени в инъецированных бластоцистах обнаруживается 7.9±1.8 % окрашенных клеток, число которых прогрессивно снижается до уровня 4.4±2.7 % при увеличении длительности культивирования до 24 ч, как и в случае инъекции в полость бластоцисты МСВ с последующим прокрашиванием бластоцист через 15, 30 мин, 1, 2, 3 и 24 ч (табл. 1).
Распределение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в полости бластоцисты после МИ
Было показано, что клетки ПЭФ гибридных мышей на первом пассаже (рис. 22, а) продуцируют зеленый белок GFP (ПЭФ-GFP) с разной интенсивностью (рис.22, б). Для МИ клетки ПЭФ-GFP были отобраны под флуоресцентным микроскопом с максимальной интенсивностью свечения, которые были инъецированы в полость бластоцисты. В ходе этих экспериментов было установлено, что клетки ПЭФ-GFP встраиваются в абсолютное большинство инъецированных бластоцист, локализуясь в составе ТБ. Сравнение с результатами опытов по МИ трансфицированных клеток Cos-1-GFP показывает, что клетки ПЭФ-GFP более эффективно включаются в состав бластоцист, чем клетки Cos-1-GFP (91.7 % против 28.6 % соответственно). На рис. 23 показаны изменения морфологии химерной бластоцисты, в составе которой находятся клетки ПЭФ-GFP, в течение 3-х суток культивирования in vitro.
Распределение первичных эмбриональных фибробластов мыши линии С57В1/6 х C57Bl/6TgN (ACTbEGFP)lOsb в бластоцистах мыши: (а, б) -сразу после микроинъекции, {в, г) - через 24 ч, (д, е) через 48 ч и (ж, з) -12 ч культивирования iv vitro. Видно, что после МИ в бластоцисту эти клетки обнаруживают интенсивное свечение в области ТБ (рис. 23, а, б), которое сохраняется в течение всего периода культивирования бластоцисты в окружении z. pellucida (рис. 22, в, г), но после выхода зародыша из зоны (рис. 23, д, е), а также вначале формирования адгезивной колонии на 3-й сутки культивирования (рис. 23, э/с, з) происходит резкое снижение интенсивности флуоресценции белка GFP. К этому времени в колониях ЭК обнаруживаются лишь единичные слабо светящиеся клетки ПЭФ-GFP, расположенные по периферии колонии (рис. 23, ж, з).
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что резкое снижение интенсивности свечения ПЭФ-GFP наблюдается только после выхода химерного зародыша из z. pellucida. В этот период клетки ТБ, согласно нашим данным с использованием цитокина LIF (рис. 11, табл. 4), обладают более высокой пролиферативной (функциональной) активностью по сравнению с клетками ВКМ и могут влиять на клетки ПЭФ-GFP, находящиеся в составе ТБ. С другой стороны, нельзя было исключить из внимания возможность подавления экспрессии гена gfp в ходе раннего развития при формировании из химерного зародыша первичной колонии ЭК, Поэтому качестве контроля были проведены в дополнительные исследования на интактных бластоцистах гибридных мышей F1 с постоянной экспрессией гена gfp (рис. 24).
Было показано, что бластоцисты мышей с постоянной экспрессией гена gfp после выделения из матки (рис. 24, а, б), а также в условиях культивирования in vitro (рис. 24, в — е) интенсивно светятся в ультрафиолетовом свете при длине волны 488 нм. Флуоресценция зеленого белка GFP обнаруживается в клетках ВКМ и ТБ на всех этапах культивирования, включая выход бластоцисты из z. pellucida и адгезию на митомициновый фидер ПЭФ (рис. 23, д, е). Однако в процессе формирования первичной колонии и распределения клеток ВКМ и ТБ на подложке ПЭФ через 5-6 суток культивирования наблюдается снижение интенсивности свечения белка GFP вплоть до полной потери флуоресценции в клетках ТБ на периферии колонии (рис. 24, ж, з). К этому времени слабая флуоресценция обнаруживается в компактной группе клеток ВКМ в центре колонии.
Рисунок 24. Морфология развития интактных бластоцист мыши линии C57Bl/6TgN (ACTbEGFP)lOsb в среде Виттена сразу после выделения (а, б), через 24 ч (в, г), через 48 ч на митомицином фидере (д, е) и через 5 суток in vitro {ж, з). ЗП - зона пеллюциды, ТБ - клетки трофобласта, ВКМ - клетки внутренней клеточной массы, пЭК - первичные колонии эмбриональных клеток. Данные по культивированию бластоцист с постоянной экспрессией гена gfp, свидетельствуют о том, что синтез этого белка подавляется в связи с началом роста и дифференцировки клеток ТБ in vitro. На 3-й сутки культивирования 50 % бластоцист с фенотипом GFP перестают светиться в результате потери способности продуцировать флуоресцентный зеленый белок GFP. На 6-е сутки, когда клетки ТБ достигают максимальной метаболической и пролиферативной активности, доля таких бластоцист составляет 78.1%.
Такая динамика снижения интенсивности продукции белка GFP в условиях пролонгированного культивирования бластоцист in vitro свидетельствует о том, что экспрессия гена gfp в раннем эмбриогенезе находится под контролем регуляторных факторов, вырабатываемых клетками ТБ. Таким образом, стадия формирования из бластоцист мышей первичных колонии ЭК характеризуется сложными взаимодействиями между клетками ТБ иВКМ.
Эффективность развития химерных бластоцист мыши в культуре.
Согласно нашим данным, эффективность развития химерных бластоцист мышей линии NMRI после МИ клеток с постоянной (клетки ПЭФ с фенотипом GFP) и временной (трансфицированные клетки линии Cos-1) экспрессией гена gfp была выше, чем у интактных зародышей (контроль 1), не подвергавшихся процедуре МИ (рис. 25). Данные, приведенные на рис. 25, показывают, что прокол блестящей оболочки и клеточных мембран стимулирует выход зародышей на стадии бластоцист и их последующее развитие бластоцисты в культуре (контроль 2, введение в полость бластоцисты МСВ).
Однако следует отметить, что на 3 сутки культивирования химерных бластоцист выявлялись различия в эффективности их развития в зависимости от генотипа инъецированных клеток (рис. 25). Химерные бластоцисты со встроенными в ТБ трансфицированными клетками Cos-1-GFP после выхода из z. pellucida и адгезии развивались достоверно лучше, чем химерные бластоцисты, полученные на основе клеток ПЭФ-GFP. Полагаем, что основной причиной высокой эффективности культивирования бластоцист с клетками Cos-1-GFP является более быстрое подавление экспрессии чужеродного плазмидного гена gfp в составе химерного зародыша (рис. 21), чем в клетках ПЭФ-GFP, в которых этот ген постоянно присутствует в геноме (рис. 23).
Эффективность развития бластоцист мышей линии NMRJ в условиях пролонгированного культивирования в среде Виттена без цитокина LIF. интактные бластоцисты (контроль 1) и химерные бластоцисты со встроенными в трофобласт клетками: () - Cos-І и (S) - ПЭФ, экспрессирующими ген gfp; () - бластоцисты после МИ в полость среды Виттена (контроль 2).
Кроме того, химерные бластоцисты, независимо от того, с помощью каких GFP-клеток они были получены, в условиях пролонгированного культивирования в виде первичных колоний теряют интенсивность свечения флуоресцентного белка GFP. В то же время, бластоцисты, которые по каким-то причинам не вышли из z. pellucida и не продолжили свое развитие, постепенно деградировали и разрушались, но при этом инъецированные клетки длительно сохраняли яркое свечение, что свидетельствует об активности белка GFP.
