Взаимодействие ароматических лигандов с олигонуклеотидами заданных последовательностей Завьялова, Оксана Стефановна

Введение к работе

Актуальность исследования

Одной из важных проблем современной молекулярной биофизики является установление закономерностей взаимодействия нуклеиновых кислот с биологически активными веществами. С решением этой задачи связано, в частности, совершенствование существующих и создание новых препаратов, способных направленно подавлять размножение вирусов и рост опухолевых клеток путем специфического связывания с теми нуклеотидными последовательностями в ДНК и РНК, которые характерны для вирусов и трансформируемых клеток. Наибольший интерес с точки зрения физики нуклеиновых кислот и их возможных конформационных изменений представляет интеркаляционное связывание ароматических лигандов с двойной спиралью ДНК. Несмотря на то, что к настоящему времени опубликовано большое число научных работ, посвященных изучению особенностей взаимодействия ароматических лигандов с нуклеиновыми кислотами, остается ряд нерешенных вопросов, связанных, например, с установлением молекулярного механизма действия подобных биологических соединений, сик-венс-специфичности связывания ароматических веществ с определенными нуклеотидными последовательностями. Сложность строения и конформа-ционная изменчивость полимерных молекул нуклеиновых кислот, большое разнообразие мест связывания лиганда в полимерной цепи ограничивают возможности анализа роли тех или иных взаимодействий в стабилизации молекулярных структур и установлении физических закономерностей мо-лекулярно-биологических процессов. Вместе с тем, экспериментально установлено, что общие принципы избирательного взаимодействия биологически активных веществ с генетическим материалом клетки могут наблюдаться уже на коротких нуклеотидных последовательностях. Следовательно основные особенности молекулярного механизма действия биологически активных веществ, селективность связывания лигандов с определенными сайтами в олигонуклеотидной цепи, энергетические и структурные характеристики комплексов ароматических молекул с нативными ДНК и РНК могут быть выявлены путем изучения их взаимодействия с малыми фрагмен-

тами нуклеиновых кислот - олигонуклеотидами различного нуклеотидного состава и последовательности оснований в цепи. Экспериментальные методы одно- и двумерной 'Н-ЯМР спектроскопии являются наиболее эффективными для подобных исследований.

Цель настоящей работы - установление основных физических закономерностей селективности связывания ароматических молекул красителей с компонентами нуклеиновых кислот, исследование влияния нуклеотидного состава и последовательности оснований в цепи на особенности процессов комплексообразования молекул.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные научные задачи:

1. разработь методики определения структурных и термодинамических параметров комплексообразования ароматических лигандов с олигонуклеотидами на основе изучения концентрационных и температурных зависимостей протонных химических сдвигов взаимодействующих молекул и данных 2М ЯМР-спектроскопии;

2. определить равновесные константы и термодинамические параметры комплексообразования ароматических лигандов с олигонуклеотидами в растворе; провести анализ динамического равновесия молекулярных ассоциа-тов и комплексов лиганд-олигонуклеотид, образующихся в растворе;

3. выявить особенности межмолекулярных взаимодействий, физической природы сиквенс-специфичности связывания ароматических лигандов с определенными сайтами олигонуклеотидных последовательностей.

Научная новизна.

-установлено, что характеристики процесса самоассоциации ароматических лигандов существенно зависят от структуры их хромофоров и наличия боковых цепей и групп. Так, самоассоциация молекул акридиновых красителей профлавина (ПФ) и акридинового оранжевого (АО) носит явно выраженный кооперативный характер, для фенантридинового красителя бромистого этидия (ЭБ) кооперативность практически отсутствует, а для фе-ноксазонового антибиотика актиномицина D ( AMD ) процесс агрегации

имеет антикооперативный характер;

-получены количественные данные, показывающие, что параметры самоассоциации дезокситетрануклеотидов и их термическая стабильность в растворе существенно зависят от состава и последовательности азотистых оснований в нуклеотидной цепи; стабильность дезокситетрануклеотидных дуплексов убывает в следующем ряду: d(CpGpCpG)₂ > d(GpCpGpC)₂ > d(TpGpCpA)₂ > d(ApCpGpT), > d(ApGpCpT)₂;

-установлено преимущественное связывание акридинового красителя GO и фенантридинового красителя ЭБ с пиримидин-пуриновой последовательностью оснований в тетрануклеотидом дуплексе, при этом прочность связывания ПФ уменьшается в следующем ряду: d(CpGpCpG) > d(GpCpGpC) > d(ApCpGpT) > d(ApGpCpT) и зависит от того, какие нук-леотиды фланкируют участок связывания с лигандом;

-показано, что акридиновый краситель ПФ встраивается со стороны большой, а фенантридиновый краситель ЭБ - со стороны малой бороздки ДНК, что связано с особенностями химического строения фенантридинового и акридинового красителей;

-проведен теоретический анализ экранирования протонов ПФ и ЭБ нуклеотидными парами G:C и А:Т в интеркалированном комплексе при вариациях конформационных параметров спирали; результаты расчетов свидетельствуют о различном вкладе трансляционных и угловых конформационных параметров спирали в экранирование протонов симметричной (ПФ) и несимметричной (ЭБ) молекул ароматических красителей;

-определены пространственные структуры наиболее вероятных комплексов молекул красителей ПФ и ЭБ с дуплексами изученных дезокситетрануклеотидов на основе рассчитанных значений предельных протонных химических сдвигов и 2M-NOESY спектров;

-обоснована методика определения термодинамических параметров комплексообразования красителей с дезокситетрануклеотидами; установлены термодинамические особенности связывания ЭБ с одно- и двухцепо-чечными изомерными тетрануклеотидными последовательностями d(AGCT) и d(TGCA); рассчитаны вклады различного типа реакций в рас-

творе (образование 1:1, 2:1, 1:2 и 2:2 комплексов) в суммарные тепловые и энтропийные эффекты; сделан вывод о характере физико-химических взаимодействий, ответственных за связывание красителя с исследуемыми последовательностями.

Научно-практическая значимость работы. Результаты, полученные в диссертационной работе углубляют знания и уточняют существующие представления об особенностях процессов взаимодействия биологически активных ароматических веществ с нуклеиновыми кислотами. Класс ин-теркалирующих веществ достаточно широк и разнообразен по своим медико-биологическим проявлениям. Примером могут служить противоопухолевые антибиотики актиномицин D, эллиптицин, дауномицин, красители акридинового ряда профлавин, акридиновый оранжевый, обладающие мутагенной, канцерогенной активностью, краситель бромистый этидий, проявляющий трипаноцидное действие. Разработанные в диссертации методики, алгоритмы и программы анализа концентрационных и температурных зависимостей экспериментальных параметров ПМР-спектроскопии позволяют проанализировать закономерности равновесия "олигонуклеотид-ароматический лиганд" в растворе, найти константы образования различного вида комплексов и, соответственно, сделать выводы о сиквенс-специфичности связывания лиганда, определить структуры образующихся молекулярных комплексов, дифференцировать вклады различных реакций комплексообразования в суммарные тепловой и энтропийный эффекты при взаимодействии интеркалятора с олигонуклеотидами в растворе. Предложенные в диссертации методики расчета структурных и термодинамических параметров применимы для анализа молекулярного механизма селективного связывания ароматических лигандов с короткими фрагментами как од-ноцепочечных, так и двухспиральных ДНК в условиях сложного равновесия в растворе. Полученные результаты и выводы работы могут быть использованы в научных исследованиях по изучению процессов молекулярного "узнавания" в различных физико-химических и биологических системах и положены в основу дальнейших работ в области разработки биологи-

чески активных веществ и лекарственных препаратов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы

представлялись и докладывалисть на I Всесоюзной конференции по теоретической органической химии (Волгоград, октябрь 1991); 32-м Международном Санибел-симпозиуме (Флорида, США, март 1992); IX Всесоюзном семинаре "Структура и динамика молекул и молекулярных систем" (Черноголовка, апрель 1992); III Международном конгрессе по теоретической органической химии (Тойохаши, Япония, июль 1993); 35-м Международном Санибел-симпозиуме (Флорида, США, март 1995); Международной научной конференции, посвященной 150-летию Ивана Пулюя (Тернополь, май 1995); XII Международном совещании по ЯМР спектроскопии (Манчестер, Великобритания, июль 1995); Международном Рабочем совещании по проблемам ЯМР спектроскопии высокого разрешения (Севастополь, сентябрь 1995); XIII Национальной школе-семинаре с международным участием "Спектроскопия молекул и кристаллов" (Сумы, апрель 1997). Тезисы перечисленных докладов опубликованы.

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 16 печатных работах.

Структура и объём диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, двух приложений и списка цитируемой литературы, содержащей 201 наименование на русском и английском языках. Материал диссертационной работы изложен на 127 страницах машинописного текста (без рисунков, таблиц и списка литературы), 56 рисунков на 38 страницах, 43 таблицы на 29 страницах.