Введение к работе
Актуальность исследования
Нитрит ионы относятся к числу наиболее токсичных и долгоживущих соединений азота. Наряду с нитратами нитриты поступают в организм человека экзогенно с водой и пищей, а также образуются эндогенно из окиси азота или за счет восстановлении нитратов микрофлорой (Green L. et al. 1982, Hartman Ph. 1982, Bruning-Fartn С et al. 1993 ). Нитриты вызывают поражение ЖКТ, обладают канцерогенным действием. При попадании данных соединений в кровь возникает метгемоглобинемия различной степени тяжести (Keatling J. P. et al, 1973). В некоторых случаях (чаще всего у детей) это заболевание приводит к летальному исходу.
В настоящее время безопасные и эффективные средства лечения нитрит индуцированной метгемоглобинемии отсутствуют (Бурбелло Ф.Т. с соавт., 1991, Coleman MD., 1996). Это во многом объясняется тем, что механизм взаимодействия нитрита и гемоглобина остается неясным.
Многие исследователи отмечают, что трудности в изучении процессов с участием нитрита объясняются отсутствием надежных методов измерения концентрации нитрита в биологических объектах. Кислая среда, необходимая для колориметрического определения концентрации нитрита (например по методу Грисса), создает условия для взаимодействия нитрита и аскорбата, что приводит к потерям нитрита и искажению результата анализа (Riise Е., Berg-Nielsen К., 1990). Кроме того, большинство методов неприменимы для анализа содержания нитрита в биологических объектах, где измерению мешают мутность раствора, наличие восстановителей, некоторых органических и неорганических веществ. Таким образом, разработка метода, позволяющего проводить измерение концентрации нитрита при нейтральных рН в мутных образцах при наличии аскорбата и других восстановителей, является актуальной и практически важной.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было выяснение механизма развития нитрит индуцированной метгемоглобинемии, роли антиокислителей и других
физиологически активных соединений в данном процессе, определение путей его предотвращения.
В работе были поставлены и решались следующие задачи:
-
Разработка нового метода количественного определения нитритов в биообъектах.
-
Исследование воздействия нитрита на активность антиокислительных ферментов (каталазы, гемовых пероксидаз) с целью выяснения
возможной физиологической роли данного воздействия.
3. Определение роли перекиси водорода и других активных форм
кислорода на различных стадиях процесса путем использования
антиокислительных ферментов, неферментных антиоксидантов, а также
соединений, способных окисляться в пероксидазной реакции.
4. На основании данных, полученных на модельных системах, получить
представление о механизме нитрит индуцированного окисления
гемоглобина в условиях in vivo.
Новизна исследования
С помощью калориметрического метода регистрации кинетики ферментативных реакций (Титов В.Ю. и др. 1988, Петренко Ю.М. и др. 1989) впервые показано, что нитрит в концентрациях 10"5 - 10"6 М, т.е. реально встречающихся в органах и тканях, способен обратимо ингибировать каталазу в присутствии нормальных для плазмы крови концентраций хлорида и тиоцианата, а также в присутствии бромида. Используя каталазу как детектор на нитрит ион, мы разработали новый метод количественного определения нитритов в биообъектах (Титов В.Ю. и др, 1997,1998).
Мы исследовали кинетические закономерности окисления гемоглобина в присутствии нитрита и ряда биологически активных веществ и установили, что способностью блокировать нитрит индуцированное окисление гемоглобина обладают соединения, способные окисляться в пероксидазной реакции, катализируемой метгемоглобином. На основании результатов, полученных на модельной системе, содержащей гемолизат эритроцитов или целые эритроциты, мы предложили схему взаимодействия нитрита с гемоглобином в условиях организма, что позволило нам дать рекомендации по поиску средств лечения и предотвращения нитрит индуцированной метгемоглобинемии.
Научно-практическая значимость работы
Разработанный нами метод определения нитрита при помощи каталазы как биодетектора может быть использованным не только в научных исследованиях, но и в клинике. Метод не уступает в чувствительности общепринятым методикам (Sen N. et al. 1978; Norwitz G. et al. 1986, 1987; Kaveeshwar R. et al. 1991; Емченко СВ. и др. 1993) и является в настоящее время единственным методом, за исключением предложенного Hamano Т. et al. (1998), позволяющим количественно определять нитриты в нейтральной среде и тем самым избегать неконтролируемых потерь исследуемого вещества при наличии аскорбата и других восстановителей. В отличии от последнего он не требует предварительных процедур по снижению изначальной мутности или окрашенности объекта, так как не основан на фотометрической регистрации. Таким образом, все неконтролируемые потери исследуемого вещества сведены к минимуму.
Предложенный в данной работе механизм развития индуцированной метгемоглобинемии позволяет определить характеристики, которыми должны обладать средства профилактики и купирования данного патологического процесса, подвести теоретическую базу под поиск таких средств, что сделает его более эффективным.
Апробация работы
Результаты работы были доложены и обсуждены на совместном заседании кафедры биофизики МВФ РГМУ и отдела биофизики НИИ Физико-химической медицины МЗМП РФ от 24 декабря 1999 г.
Публикации
Основное содержание диссертации изложено в 9 печатных работах.
Объем работы
Диссертация состаоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Объем диссертационной работы 120 страниц печатного текста. Список литературы состоит из 105 источников цитируемой литературы.