Введение к работе
. Актуальность темы. Исследования последних десятилетий показали, что обязательными компонентами всех без исключения биологических мембран являются эндогенные (или мембранные) фосфолипа-зы. Известно, что эти ферменты являются тонкими регуляторами функционального состояния мембран. Зто связано с тем, что изме-нение фосфолипидного состава, которое происходит под действием фосфолипаз, влечет 8а собой структурные перестройки В ЛИШ'ДНОМ остове мембраны, что, в свою очередь, приводит к изменению функциональных параметров мембраны (например, проницаемость мембраны, степень сопряженности и т. п.). Одним из важнейших не решенных до сих пор вопросов является вопрос о регуляции активности самих фосфолипаз. Почему эндогенные фссфолипаеы не "съедают" мембрану, в которой они локализованы? Почему происходит реэкая активация фосфолипаз в ответ на действие различных агонистов: гормонов, форболовых эфиров, пуриновых нуклеоткдов и др. ? Почему происходит их стимуляция при различных видах патологии? Предполагается, что решающую роль в регуляции активности эндогенных фосфолипаз играет структурная организация и физико-химическое состояние липидного окружения в мембране.
В настоящее время можно считать установленным, что в мембране помимо бислоя фосфолипиды могут образовывать агрегаты различной структуры (нормальные и обращенные мицеллы, обращенную гексагональную фазу). Эти агрегаты, по-видимому, по-разному подвержены действию фосфолипаз. Поэтому изменение структурной организации мембран ( например, появление в ней небислойных участков) может оказывать воздействие на эндогенные фосфолипаяы. О другой сторона, активация мембранных фосфолипаз, как отмечалось выше, приводит к изменению структуры мембран, в частности, к появлению в них небислойных участков.
Принятые сокращения: ФЛ-1) - фосфолипаза D, ПАВ - поверхностно-активные вещества,' DS-Na - додецилсульфат натрия, ЦТАЬ - це- . тилтриметиламмоний бромистый, АОТ - аэрозоль ОТ (натриевая соль ди-(2-этил)-дигексилового эфира сульфоянтарной кислоты), ФХ -фосфатидилхолин, ФЭА - фосфатидилэтаноламин, ФК - фосфатидная кислота, лФК - лизофосфатидная кислота, ФО - фосфатидилсерин, Ш - фосфатидилинозит, ДШХ - димиристоилфосфатидилхолин, ДЫФК -димистоилфосфатидная кислота
Такий образом, в клетке имеется тонкий механизм взаимной регуляции каталитической активности липолитических ферментов и структуры мембран. В связи с этим представляется весьма важным вопрос о зависимости каталитической активности фоефолкпаз от структурного физико-химического состояния фосфолипидного окружения в мембране. Изучение этой зависимости непосредственно на би-омембранах, как правило, трудно реализовать из-за сложного строения живой материи и одновременного протекания множества взаимосвязанных метаболических процессов. Поэтому для решения данной пробле-vii более приемлемы искусственные системы с известной структурной организацией, моделирующие различные фосфолипидные агрегаты, существующие в биологических мембранах.
Одним из компонентов липолитической системы является ФЛ-D, катализирующая реакции гидролиза фосфолипидов с образованием ФК и водорастворимых оснований, а также реакции трансалкилирования, то есть замещения спиртовой группы в полярной части молекул фосфолипидов. До настоящего времени были изучены физико-химические свойства ФЛ-D, кроме того фермент использовался в качестве "инструмента" при исследовании функций биомембран и для изучения закономерностей гетерогенного катализа, йізиодогическая роль ФЛ-D в функционировании различных органелл и клетки в целом, а также возможные пути регуляции функциональной активности этого фермента практически не изучены. Настояпая работа посвяцэ-ка изучению ФЛ-D в системах с разной структурной и физико-химической организацией субстрата.
Настоящая работа представляет собой часть фундаментальных исследований, проводимых на кафедре биофизики биологического факультета ТашГУ по теме: "Принципы функционирования биологических мембран и механизмы действия ыембраноактивных соединений" -(Госрегистрация N01890060178)..
Яель и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы было изучение гидролитической и трансферазной активностей ФЛ-D в зависимости от структурного состояния субстратной фазы.
Для достижения указанной цели в работе были поставлены конкретные задачи, решение которых выносится на защиту:
1. Изучение действия ФЛ-D на субстраты с бислойной организацией (озвученные липосомы, мультислойные ламеллы, биологические мембраны).
. 2.. Изучение активности №D в смешанных мицеллах детергента и фосфолипида.
-
Изучение действия ФЛ-D в системах на основе ПАВ - вода -органический растворитель.
-
Изучение скорости гидролиза субстрате. ФЛ-D в зависимости от фазового состояния субстрата "гель - жидкий кристалл".
Научная новизна работы. В диссертационной .работе показана зависимость активности ФЛ-D от тили организации субстрата: наибольшая активность фермента наблвдается в составе обращенных мицелл, наименьшая - при взаимодействии с бислоями. При изучении активности ФЛ-D.в составе смешанных мицелл детергента и ФХ показано, что активность фермента зависит от соотношения детергента и фосфолипида, которое определяет тип и размер агрегатов.
В работе были использованы тройные системы ПАВ - вода - органический растворитель для моделирования структурной организации липидного окружения ФЛ-D. В том числе, впервые обнаружена каталитическая активность ФЛ-D в гидратированных обращенных мицеллах ПАВ в органическом растворителе.. Изучена зависимость скорости гидролиза ФХ ФЛ-D от степени гидратации ПАЕ
При изучении активности ФЛ-D в зависимости от фазового состояния "гель - жидкий кристалл" впервые установлено, что в точке фазового перехода активность фермента значительно выше, чем при гидролизе субстрата, находящегося в жидко-кристаллическом состоянии.
Научная и практическая значимость. Проведенные исследования дают описание закономерностей гидролиза фосфолипидов ФЛ-D в системах с различной организацией субстрата. Принимая во внимание реалистичность данных систем как моделей фрагментов биомембран, результаты работы могут иметь важное значение в понимании механизма регуляции мембранных фосфолипаз структурой биомембран и структурными перестройками в них.
. При изучении особенностей трансферазной активности ФЛ-D разработан способ получения фосфолипидов, который может найти применение в медицине, фармакологии, косметологии и пищевой промышленности.
Разработанные методические подходы определения активности ФЛ-D в системах с различной организацией субстратной фазы могут найти применение в практических учебных занятиях на кафедрах би-
- 6 -
офизики, биотехнологии и биохимии.
Апробация работа Основные результаты работы были доложены на следующих международных и всесс^зных конференциях: на IV конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана (Ашхабад, 1986), на VI и YII Всесоюзных симпозиумах, по Инженерной энзишлогии (Вильнюс, 1988, ІЬсква, 1991), на X Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР - ГДР (Ташкент, 1989), на 1&ждународной школе молодых ученых "Современный ассиметрическмй синтез. Биокатализ в органическом синтезе" (Алушта, Крым, 1991), на объединенном заседании кафедр биофизики, биохимии и биотехнологии биологического факультете ТашГУ (19Я2), на семинаре Института физиологи и биофизики АН Республики Узбекистан (1992).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных робот.
Структура и объем работы. Диссертационная работа представляет собой рукопись, изложенную на 181.стр. машинописного текста, включает 18 таблиц, 28 рисунков, а также список цитированной литературы из 245 наименований. Диссертационная работа состоит из введения,, обзора литературы/' экспериментальной части, содержащей описание материалов и методов, используемых в работе, результатов и их обсуждения (в 5 частях), заключения, выводов и списка цитируемой литературы.