Введение к работе
Актуальность проблемы. Метилирование ДНК ферментами модификации -ДНК-метилтрансферазами - является важнейшим способом передачи наследственной информации, не закодированной в нуклеотидной последовательности ДНК. У эукариот метилирование ДНК неотделимо от протекания таких биологических процессов, как генная экспрессия, эмбриональное развитие, геномный импринтинг, инактивация Х-хромосомы, генетические мутации. Изменение «карты» метилирования ДНК приводит к нарушению генной экспрессии и, как следствие, влияет на возникновение и развитие некоторьж заболеваний. У прокариот метилирование ДНК тесно связано с процессами репликации и репарации. В связи с этим актуальной задачей становится изучение особенностей регуляции экспрессии генов, кодирующих ДНК-метилтрансферазы (МТазы).
Объектом нашего исследования является С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза SsoII (M.SsoII), входящая в систему рестрикции-модификации SsoII. Системы рестрикции-модификации (Р-М) служат защитным механизмом прокариотических организмов от проникновения в клетку чужеродной ДНК. Известно несколько типов регуляции экспрессии генов МТаз в системах Р-М. К началу выполнения настоящей работы было показано, что M.SsoII способна осуществлять авторегуляторную функцию, формируя специфический комплекс с промогорной областью генов системы Р-М SsoII (Karyagina et al, 1997; Shilov et al, 1998). Таким образом, M.SsoII действует в клетке не только как фермент модификации, но и как транскрипционный репрессор.
Информация, полученная в ходе выполнения работы, -способствует расширению представлений о структурно-функциональных аспектах поведения M.SsoII как бифункционального белка. Выявленные для M.SsoII особенности узнавания ДНК могут быть перенесены на эукариотические МТазы, так как все С5-цитозиновые МТазы имеют сходную первичную структуру и для них постулирован единый механизм катализа.
Целью настоящей работы являлось сравнительное биохимическое исследование специфических ДНК-белковьж комплексов M.SsoII с участком метилирования и с промоторной областью генов системы Р-М SsoII. Для решения поставленной задачи использован комплексный подход, включающий идентификацию групп атомов ДНК (методом «отпечатков») и аминокислотных остатков фермента (методом региоселективного ковалентного присоединения нуклеиновой кислоты к белку), участвующих в формировании ДНК-белковы\ комплексов; расчет констант диссоциации при взаимодействии M.SsoII с ДНК-
лигандами; компьютерное моделирование белково-нуклеиновьж взаимодействий в комплексах M.SsoII с промоторной областью генов системы Р-М SsoII и с участком метилирования в ДНК. Самостоятельной задачей стала разработка методики определения местоположения неметилируемого dC в участке узнавания цитозиновых МТаз.
Научная новизна и практическая ценность. Впервые проведено всестороннее исследование ДНК-белковых контактов для фермента M.SsoII в комплексах с участком метилирования и с промоторной областью генов системы Р-М SsoII. Идентифицированы группы атомов ДНК, существенные для формирования специфических комплексов с M.SsoII. С помощью ДНК-дуплексов, содержащих фосфорилдисульфидную группу вместо природной фосфодиэфирной межнуклеотидной связи, впервые показана сближенность Cysl42 каталитического центра M.SsoII с углеводофосфатным остовом ДНК при взаимодействии, как со специфическими, так и с неспецифическими лигандами. Методом ковалентного присоединения M.SsoII к ДНК-дуплексам, содержащим альдегидную группу в Т-положении углеводного фрагмента, продемонстрировано, что в связывании с промоторной областью генов системы Р-М SsoII могут участвовать две молекулы фермента. Построены молекулярные модели комплекса С-концевой части M.SsoII с участком метилирования ДНК и аналогом кофактора 8-аденозил-Ь-гомоцистеином, а также комплекса N-концевого участка M.SsoII с промоторной областью. Проведенные исследования позволили сравнить специфические ДНК-белковые комплексы, формируемые M.SsoII с участком метилирования и с промоторной областью генов системы Р-М SsoII, и предложить модель взаимодействия этой МТазы с ДНК как бифункционального белка. Универсальная схема комплексного исследования М SsoII, предложенная в работе, может быть использована для изучения других ферментов нуклеинового обмена Разработана методика определения местоположения неметилируемого dC в участке узнавания цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, основанная на использовании бисульфитной реакции в сочетании с ферментом репарации урацил-ДНК-гликозилазой. С помощью предложенного подхода установлена специфичность действия метилтрансферазы NlaX.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ. Результаты были представлены на конференциях «Biocatalysis-2000: fundamentals and applications» (Москва, июнь 2000 г.), «Trends in Nucleic Acid Chemistry» (Москва, ноябрь 2000 г.), «5th International Meeting on Recognition Studies in Nucleic Acids (NACON-V)» (Шеффилд, Великобритания, апрель 2001 г.), Ш-м съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, июнь-июль 2002 г.), конференциях
«Computational Molecular Biology» (Москва, июль 2003 г.), «Molecular Biology and Genetics» (Киев, Украина, сентябрь 2003 г.), V-ом симпозиуме «Nucleic Acids Chemistry & Biology» (Кембридж, Великобритания, сентябрь 2003 г.), конференциях «Biochemistry of Nucleo-Protein Complexes» (Гиссен, Германия, апрель 2003 г. и январь 2004 г.).
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на /57 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен молекулярным аспектам взаимодействия белков семейства С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз и семейства Сго-белков и репрессоров с ДНК), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован jj рисунками, Q схемами, It) таблицами. Библиографический указатель включает в себя IQQ- цитированных работ.
Похожие диссертации на C5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза Ssoll как бифункциональный белок: изучение взаимодействия с участком метилирования и с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации Ssoll
