Введение к работе
Актуальность тег.м
Развитие промышленного мккроблалъного синтеза в СССР с целью производства кормовых добавок и биологически активних вещастп требует углубления существующих представлений о биохимических особенностях бактерий, о регуляции клеточных процессов и о влиянии внесших факторов на биохимию и биофизику клетки. 3 первую очередь эта информация необходима для селекции мутантних штаммов - продуцентов биологически полезных веществ. Получение такой информации - чрезвычайно слонная и трудоемкая задача. Например, изучение метаболических путей требует применения изотопномеченкх соединений, экстракции и очистки ферментов, использования аналогов метаболитов в качестве ингибиторов ферментативных реакций и т.д. Изучение клеточной регуляции еще более сложная задача, решение которой все более основывается на построении и численном анализе мгогсмерных нелинейных математических моделей и косвенных экспериментальных данных. Анализ метаболіічесгаїх изотопных эффектов с помощью теоретических моделей, связывающих изотопные характеристики организма с особенностями его метаболизма, позволяет получить новую, принципиально важную информацию о временной организации работы клетки, открывает новый и относительно простой путь изучения механизмов регуляции.. Кроме того, характер внутримолекулярных изотопных распределений метаболитов может быть использован для уточнения отдельных участков метаболических цепей, а изучение изменений изотопного состава СО2 дыхания - для контроля функциональных состояний организмов. Эти и другие возможности ис-пользовашш метаболических изотопных эффектов для решения важной практической задачи повышения эффективности микробпального синтеза свидетельствуют об актуальности нашей работы.
Цель работн заключалась в том, чтобы, экспериментально проворив центральный постулат выбранной теоретической модели (Квлев, 1985) об определяющей ролі! изотопных: эффектов дскарбо-ксилирования пирувата в распределении изотопов углерода в клетке, использовать ее дія выяснения особенностей синтеза лизина и глуташшовой кислоты у ауксотрофных мутантов корине'бактерий, продуцирующих эти аминокислоты, и установить связь между путями синтеза аминокислот, и природой потребляемого субстрата, попытаться выявить биофизические механизмы функционирования клетки.
Дшї достижения этих целей было необходимо решить следующие методические и научные задачи:
1. Создать и отладить следующую единую методическую последо
вательность частей: а) культивирование бактерий, б) выделение
аминокислот из культуралъной жидкости и очистка их от примесей,
в) декарбоксилирование аминокислот с выделением отщепляемой СС^,
г) подготовка образцов к прецизионному изотопному анализу угле
рода аминокислоты, ее карбоксильной группы, углерода субстрата
и биокассы бактерий, углерода С02> рєсішрируемого бактериями в
процессе культивирования, д) масс-спектрометрнческкй изотопный
анализ к оценка точности определений. Все методики разрабатыва
лись с учетом требования полноты очистки и химического превра
щения форм, вытекающего из условия прецизионности.
2. Выявить наличие внутримолекулярных изотопных различий .в
аминокислотах, продуцируемых ауксотрофными мутантами коринебак
терій,
-
Провести эксперименты по выявлению влияния кинетического изотопного эффекта декарбоксилирования пирувата на внутримолекулярное распределение изотопов углерода в аминокислотах.
-
Установить связь меаду внутримолекулярными изотопными распределениями аминокислот и путями их биосинтеза, а такке тех
и других с природой потребляемого субстрата.
-
Алатазируя совокупность изотопных данных, в том числе: изотопный состав углерода биомассы, субстрата, аминокислоты и ее карбоксильного углерода, исследовать временную организацию биосинтетических превращений в клеточном цикле коринебактерій.
-
Исследовать динамику изменений изотопного состава С02, выделяемого коринебактерияш в процессе культивирования, и-ее связь с организацией клеточного цикла.
Научная говизпа
Впервые экспериментально доказано 1ц. v'-vo существенное влияние кинетического изотопного эффекта декарбоксияировашш шрузата на внутримолекулярное распределение изотопов углерода в аминокислотах.
Впервые в экспериментах In vivo получено подтверждение существования в гликолитической цепи клеток бактерии реципрок-ных колебаний.
Получены новые доказательства связи изотопных распределений метаболитов (аминокислот) с путями их биосинтеза. Обнаружено, что синтез лизина у B.-ftiivubvi, 33-531 п C.^U4il^V.<<»*E-95-I0 происходит диаминопнмелиновшл путем с участием гллокснлатного цикла. Получены доказательства интенсивного липидно-углеводного обмена и функционирования фосфоглюконатного цикла у C.gtaia^-'--tutu 3144.
Впервые обнаружено, что у разных бактерий включение экзогенного субстрата в метаболизм может происходить на разных этапах клеточного цикла. У В.-ffown 25-531 и С.с^к-Тдщ.'сш-и. 3144 включение экзогенного ацетата происходит преимущественно в фазу Гликолиза, у С.п1и.{ал-*'~си.*ы. E-95-I0 - преимущественно в фазу глюконеогене за.
Апробация работы
Результаты работы докладывались на конференции научных сотрудников и преподавателей ТСХА (г.Москва, 1988 г.), ХП Всесоюзном симпозиуме по стабильным изотопам в геохимии (г.Москва, 1989 г.), П Всесоюзном'совещании по проблеме "Физиологически активные соединения, меченые радиоактивными и стабильными изотопами" (г.Звенигород, 1988 г.), У Всемирном симпозиуме "Изотопы в природе" (г.Лейпциг, 1989 г.)
Публикации по теме диссертации
По результатам работы тлеется 8 публикаций.
Объем и структура диссертации
