Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Классификация и доменная организация иммуноглобулинов. 10
1.2. Клонирование иммуноглобулинов и их фрагментов. 12
1.2.1. Экспрессия иммуноглобулинов и их фрагментов в гетерологичных системах. 14
1.3. Создание комбинаторных библиотек антител. 15
1.3.1. Метод фагового дисплея. Основные принципы. 16
1.3.2. Строение нитевидного фага и его жизненный цикл. 18
1.3.3. Геном фага fl и его продукты. 19
1.3.4. Векторы для фагового дисплея. 23
1.3.5. Векторы на основе нитевидных фагов, используемые для создания библиотек миниантител. 27
1.3.6. Другие векторы, используемые в методе фагового дисплея. 29
1.4. Библиотеки миниантител. Конструирование и практическое использование. 32
1.4.1. Конструирование библиотек, основанных на комбинации синтетических CDR3. 35
1.4.2. Применение scFv. 45
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 49
2.1. Конструирование библиотеки миниантител. 49
2.1.1. Амплификация фрагментов генов вариабельных областей иммуноглобулинов. 49
2.1.2. Клонирование объединенных фрагментов легких и тяжелых цепей в E.coli. 54
2.2.1. Селекция миниантител к гранулоцитарному колонийстимулирующему фактору. 56
2.2.2. Создание тест-системы для количественного определения G-CSF. 60
2.3. Выделение миниантител. 66
2.3.1. Выделение секретируемых миниантител иммуноаффинной хроматографией. 66
2.3.2. Вьщеление секретируемых миниантител ионообменной хроматографией. 67
2.4. Получение и характеристика миниантител к транс-зеатину. 70
2.4.1. Синтез конъюгатов транс-зеатина. 71
2.4.2. Селекция миниантител к транс-зеатину. 73
ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 77
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 78
3.1. Олигонуклеотиды и праймеры. 78
3.2. Вьщеление мононуклеарных клеток. 79
3.3. Вьщеление РНК. 79
3.4. Вьщеление ДНК 80
3.5. Синтез кДНК. 81
3.6. Амплификация ДНК генов вариабельных областей иммуноглобулинов. 81
3.7. Получение линкера. 82
3.8. Сборка и амплификация объединенных фрагментов тяжелых и легких цепей Ig. 83
3.9. Клонирование scFv. 83
3.10. Амплификация библиотеки scFv. 85
3.11. Биотинилирование G-CSF. 85
3.12. Селекция G-CSF-специфичных клонов. 86
3.13. Первичный анализ селектированной библиотеки методом иммуноскрининга на чашках. 87
3.14. Клонирование последовательности ДНК, кодирующей антигенную детерминанту IL2 для антител ЛНКБ-2. 88
3.15. Синтез конъюгата биотина с транс-зеатином. 88
3.16. Синтез конъюгатов зеатинрибозида с BSA, овальбумином и аминогексилсефарозой. 89
3.17. Селекция клонов, специфичных к транс-зеатину. 90
3.18. Вьщеление секретируемых миниантител методом иммуноаффинной хроматографии. 90
3.19. Вьщеление секретируемых миниантител методом ионообменной хроматографии. 91
3.20. Определение констант аффинности миниантител. 91
ВЫВОДЫ. 93
Список литературы. 94
Введение к работе
Антитела (Ig) - один из инструментов иммунной системы, медиатор гуморального иммунитета. Они продуцируются потомками В-лимфоцитов - плазматическими клетками и обладают уникальным сродством к антигену, индуцировавшему их выработку. Связывание антитела с антигеном запускает каскад реакций, приводящий к удалению антитела из организма, а именно, активацию системы комплемента, усиление фагоцитоза.
Высокоспецифичное, высокоаффинное взаимодействие антитела с антигеном позволяет использовать антитела в исследовательских, аналитических и терапевтических целях. Антитела широко используются в иммуноанализе (ИФА, РИА и проч.), позволяя детектировать и количественно определять пикомолярные концентрации вещества в сложных смесях, например в сыворотке крови. Широчайшим образом антитела используются в настоящее время для анализа субпопуляционного состава клеток крови (метод проточной цитометрии), что позволяет характеризовать иммунный статус организма. С помощью изотопно-меченных антител проводится локализация в организме очагов опухолевого роста. В терапевтических целях антитела применяются для нейтрализации токсинов. Разрабатываются подходы к использованию антител в терапии злокачественных опухолей. Антитела находят применение в научных исследованиях для выделения (иммуноаффинная хроматография) и характеристики биомолекул.
Исторически первым источником антител была сыворотка иммунных животных и человека. Получаемые таким образом антитела содержат набор иммуноглобулинов различных классов и подклассов, специфично узнающих свой антиген. Различные антитела сыворотки узнают несколько участков (эпитопов) антигена. Таким образом, сыворотка полиспецифична, что в ряде случаев является недостатком. Дальнейшим развитием способов получения антител явилось создание гибридомной технологии, которая позволяет получать антитела, продуцируемые одним клеточным клоном, узнающие один эпитоп и сохраняющие свои свойства во многих генерациях гибридной клетки. К достоинствам моноклональпых антител можно отнести высокую специфичность, возможность получения их в больших количествах и одинаковой специфичности. К недостаткам можно отнести то, что технология получения моноклональпых антител разработана для мыши и крысы и является трудно применимой в случае антител человека, в то время как для терапевтических нужд требуются именно человеческие иммуноглобулины. Затруднения возникают и в тех случаях, когда иммунизация животных по. какой-либо причине невозможна или не удается обойти толерантность к антигену. Для разрешения этой проблемы в настоящее время предложены методы молекулярного клонирования фрагментов генов антител. Одним из таких методов является техника фагового дисплея антител. В 1990 году было показано, что антиген связывающие. фрагменты aimn (scFv, Fab), представленные на поверхности нитевидного фага, могут быть отобраны на иммобилизованном антигене [McCafferty, 1990]. Основной идеей метода является создание комбинаторной библиотеки, в которой вариабельные участки легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов соединены случайным образом и представлены на поверхности бактериофага. Каждый бактериофаг, как и В-лимфоцит, экспрессирует антитело единственной специфичности. При достаточно большом размере библиотеки репертуар вариабельных участков будет сравним с репертуаром антител в организме. К достоинствам метода можно отнести следующие:
1. Возможность отбора антител in vitro, минуя стадии иммунизации животных.
2. Отсутствие необходимости использования лабораторных животных и поддержания : долговременных культур клеток эукариот.
3. Время получения индивидуальных клонов-продуцеитов миниантител составляет 10 - 14 дней, по сравнению с несколькими месяцами в случае гибридомной технологии.
4. Относительная простота получения антител и их низкая себестоимость.
5. Возможность создания гибридных молекул с маркерными белками за короткое время.
6. Возможность получения антител к аутоантигенам и слабоиммуногенным соединениям.
С целью решения стоящих перед Институтом задач нам представлялось актуальным создание комбинаторной библиотеки миниантител мыши, в частности, получение на ее основе scFv к интересующим нас антигенам - гранулоцитарному колониестимулирующему фактору человека (G-CSF) и природному фитогормону - транс-зеатину.
G-CSF - цитокин, стимулирующий рост гранулоцитов и активирующий нейтрофилы [Cteven, 1987]. Он представляет собой гликозилироваиный полипептид с молекулярной массой 19 кДа. G-CSF применяется в онкологии для восстановления числа нейтрофилов при лейкопении, вызванной радио- или химиотерапией. Для анализа G-CSF в процессе производства и клинического применения необходимы тест-системы, причем наиболее удобными в настоящее время являются иммунохимические тест-системы на основе антител.
Траис-зсатин это один из ключевых фитогормонов, ответственных за рост и развитие растений. Несмотря на большой объем данных о роли траис-зсатина в регуляции деления и диффереицировки клеток, механизм действия этого вещества до сих пор недостаточно изучен. Использование антител, направленных против транс-зеатина, может позволить прояснить молекулярные аспекты его функционирования.
Таким образом, в задачи данного исследования входило: 1-. Создание представительной библиотеки фагового дисплея мышиных миниантител. 2. Проверка качества полученной библиотеки на примере получения фагмидных клонов, .экспрессирующих мшшантитела к белковому антигену - G-CSF и гаптену - транс-• зеатину.
3. Получение, вьщеление и характеристика миниантител к G-CSF.
4. Создание на основе полученных миниантител тест-системы для количественного определения G-CSF.
5. Получение, выделение и характеристика миниантител к транс-зеатину.
Похожие диссертации на Фаговый дисплей мышиных миниантител: получение и использование
